激光扫描共焦显微镜在检测活体组织和细胞中应用.pdf

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1、[研究与报告]激光扫描共焦显微镜在检测活体组织和细胞中的应用TheapplicationsofConfocalLaserScanningMicroscopyinlivingtissueandcell何其华（北京大学医药卫生分析中心10083）〔文章编号〕1672-8270（2004）04-43-05〔中图分类号〕R318．51〔文献标识码〕A摘要激光扫描共焦显微镜（ConfocalLaserScanningMicroscopy，以下简称Confocal）的功能决定了其在生物医学中的应用及独特的地位，它能对完整的活细胞和组

2、织或固定的细胞和组织内各种结构进行定性、定量、定时和定位的测量。但其强大的定位和动态测量功能，使Confocal尤其适合于活体组织和细胞的研究。本文简单介绍一下Confocal的原理和功能，着重阐述了Confocal在活体组织和细胞中的应用。关键词激光扫描共焦显微镜，荧光探针ThefunctionofConfocalLaserScanningMicroscopymadeithavespecialapplicationsinbiomedicine．Theproteinsinthelivingcellandtissueorf

3、ixedcellandtissuecanbelocalizedbyconfocal，andthefunctionsoflivingcellcanbemeasured．Thearticlegivesthesimpleintroductionsoftheprincipleandthefunctionsofconfocal，andalotofintroductionsaboutitsapplicationsinlivingcellandtissue．KeyWords：ConfocalLaserScanningMicroscop

4、y，fluorescenceprobes1结构及工作原理传统的荧光显微镜是采用很宽的照明光束照射在整个样品上，样品整个厚度被同时连续照明，样品的焦平面以及焦平面以外的结构共同成像，造成图像的模糊。这种现象使用高倍物镜时会更明显，调节聚焦旋钮时除焦平面的结构会成清晰图像外，非焦平面的结构同时成像，即整个厚度的样品同时成像在目镜中，但却是有些结构清晰、有些结构模糊，这使目镜中的整个图像分辨率降低，清晰度下降。当样品比较厚时，这种现象尤其突出。而激光扫描共焦显微镜解决了这个问题。首先选用激光作为光源，激光通过一个照明针孔到达样

5、品，样品只被一个具有精密几何形状的光点照射，焦平面上只有被照射到的特定点所发射的荧光通过一个针孔，到达检测器，这个针孔称为探测针孔（见图1）。计算机以像点的方式将成像点显示在屏幕上，为了产生一幅完整的图像，该照射点由光路中的扫描系统在整个样品上扫描，在显示器上达到产生一幅完整图像的目的，这幅图像即为焦平面的共焦图像。共焦显微镜之所以只检测到焦平面上被照射的点所发射的光，是由于采用了点照明和点探测，而点照明和点探测是由放置在光源前的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现的。由照明针孔发射出的光聚焦在物体焦平面的某个点上，该

6、点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射荧光均被该针孔阻挡，所以照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的（见图2），也就是说照明针孔和探测针孔具有共同的焦平面，这就是激光扫描共焦显微镜系统中共焦的真正含义。由上所述，我们知道在显示器上所成的像即为该焦平面的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移到照明针孔和探测针孔的共同焦面上，样品的这个新层面又成像在显示器上，计算机将其存在内存中，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像，我们将从共焦显微镜系统获得的连续光切图像比喻为

7、“显微CT”。从这些连续的光切图像，可得到样品真实的三维结构。图1共焦显微镜原理示意图激光器发出的照明光束通过照明针孔（ExcitationConfocalPinhole）、光束分光镜（BeamSplitter）和物镜到达样品的焦平面。光线具有穿透力，焦平面之上的结构和焦平面之下的结构均被照射，实际上，被照射的结构均会发射出荧光，通过光路到达检测器，但焦平面上被照射点之外结构所发射的荧光，均被检测器之前的针孔（DetectionConfocalPinhole）所阻挡，实现真正的点照明和点探测。2功能2．1图像静态采集2．

8、1．1多荧光探针标记样品高清晰度、高分辨率图像的采集2．1．2无损伤连续光学切片图像的采集－显微“CT”2．1．3假三维图像的显示计算机将图像采集进来后，借助软件功能可以显示假三维图，即xy平面为实际的光切图像，而z轴为荧光强度（见图10-6）。从此图，可对xy二维平面荧光强度的分布一目了然。另外假三维图像的软件还可