激光共焦扫描显微镜及其应用

《激光共焦扫描显微镜及其应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、激光共焦扫描显微镜及其应用导读：激光共焦扫描显微镜从80年代诞生至今，一直在不断完善、不断更新和升级，其应用范围也日渐扩大。　　我们知道，高分辨力和高衬度一致是显微镜设计者和使用者所致力追求的。然而普通光学显微镜受衍射极限制约，要想提高分辨力，必须使用大数值孔径的物镜。但是使用大数值孔径的物镜观察样品时，像的对比度会明显下降。如果对样品进行染色，其染料又可能杀死活的试样。因此用普通生物显微镜很难对活的生物组织如细胞、细菌等进行动态观察。而生物医学及材料科学的发展又对显微镜提出了更高的要求，不仅希望有更高的分辨力，而且

2、希望能对样品进行无损层析，进而能观察其三维图象。这是普通显微镜所不可能实现的。而基于共焦原理的激光共焦扫描显微镜却能满足以上要求，从而使传统的显微镜有了新的发展。　　共焦成像原理是由MMinsky等在50年代提出的成象思想，由于受技术条件限制，直到80年代后期，随着激光技术、计算机图象处理技术的迅速发展，才使人们逐渐认识到其重要性，并且发展成性能稳定的产品。　　激光共焦扫描显微镜是集共焦原理、激光扫描技术和计算机图象处理技术于一体的新型显微镜，是一种典型的高新技术光电仪器。其主要优点有：　　(1)既有高的横向分辨力，

3、又有高的轴向分辨力，同时能有效抑制杂散光，具有高的对比度。　　(2)能通过对物体不同深度的逐层扫描，获得物体大量断层图象，既能对物体进行层析，又能建构三维立体图象。　　(3)容易实现高倍率。　　1基本光路及成像原理　　共焦激光扫描显微镜是采用共轭焦点技术，使点源、样品及点探测器处于彼此对应的共轭位置。为了便于像差的校正以及便于系统升级，常采用准直光路。如图1所示，由激光器输出的激光束经透镜L1、针孔1及扩束透镜L2后，成为较均匀的准直光束，经物镜L3后会聚于物体某一点，该点反射光(或透射光、或受激辐射的荧光)又经物镜

4、后被分束镜反射到探测光路，由会聚透镜将其聚焦于针孔2，被探测器接收，并将其输入计算机进行存储。通过二维扫描，得到物体某一层面的二维断层图象，再经轴向扫描，得到大量断层图象，经计算机图象重构，合成三维立体图象。其扫描装置也由计算机进行控制。　　图1激光共焦扫描显微镜典型光路图　　除了图1所示基本光路外，随着荧光技术、光纤技术、彩色显微技术和光栅显微技术的引入和不断完善，衍生出一系列新型的共焦显微镜。例如共焦荧光扫描显微镜是将观察物体制成荧光样本，通过探测样本受激辐射的荧光进行成像，它更容易获得高清晰度、高分辨力的三维图

5、象；将光纤技术和共焦技术相结合研制的光纤共焦激光扫描显微镜，可以使整个系统结构紧凑、体积小、价格低、抗干扰能力强；彩色共焦光学显微镜是用红、绿、蓝三色激光作为光源，用声光偏转元件进行激光扫描，可以在电视监控器上观察到超常规光学显微镜0.3μm以下分辨力的彩色图象，又因为三色激光均为单色光，故扩大了其应用范围；此外，将光栅显微镜与共焦技术相结合而制成的共焦光栅显微镜，可以实现超分辨，其轴向分辨力可达纳米量级。　　在共焦系统中，由于整个点像分布等于物镜和聚光透镜点像分布的乘积，所以比常规显微镜有更高的分辨力。当物镜相同时

6、，其横向分辨力是常规显微镜的倍。同时由于探测器前针孔的存在，探测器只接受来自物镜焦点处的信息，焦点以外的杂散光不能通过针孔进入探测系统，因此共焦显微镜还具有较高的轴向分辨力和较高的对比度，如图2所示。　　2关键技术　　激光共焦扫描显微镜有如下一些关键技术。　　2.1共焦技术。激光共焦扫描显微镜采用点源一点探测，探测针孔的大小起着关键作用，它直接影响系统的分辨力和信噪比。如针孔过大，则起不到共焦点探测作用，既降低系统的分辨力，又会引入更多杂散光，使系统失去层析能力；如果针孔太小，则降低探测效率。研究表明，当小孔直径等于

7、爱里斑(Airydisk)的直径时，探测效率可达85%以上，且满足共焦要求。由于针孔直径等于爱里斑直径，为微米量级，如果激光束的会聚焦点与针孔位置存在偏差，将会产生信号失真，且容易引入轴外像差，影响成像质量。激光共焦显微镜一般采用自动对焦系统，当焦面保持不变时，自动对焦系统能以需要的复现性测出结构的实际宽度，以0.1μm精度对样品反射表面聚焦，调节时间小于1s。　　图2激光共焦扫描显微镜高轴向分辨力和高衬度原理图　　2.2扫描技术。由于激光共焦扫描显微镜是点物成点像，所以要想获得物体的二维图象，需要借助于x、y方向的

8、二维扫描。不同的显微镜采用不同的扫描方式，归纳起来可分为以下几种：　　(a)物体扫描，即物体本身按一定规律移动，而光束保持不变。其优点是轴线平直，光路稳定，充分发挥了光学系统中心无像差的优势。其缺点需要大幅度扫描工作台，因此扫描速度受到制约，快速扫描有一定困难。　　(b)利用反射振镜构成光束扫描系统，通过控制扫描振镜将聚焦光点有规律地反射到物体