激光共焦显微镜技术及应用

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1、激光扫描共焦显微镜技术及应用激光扫描共聚焦显微镜（laserscanningconfocalmicroscopeLSCM）是20

2、比纪80年代发展起來的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域。一.组成倒置或直立荧光显微镜、扫描头（照明针孔、探测针孔、荧

3、光滤片系统、镜扫描系统和光电倍增管）、扫描头控制电路、计算机和图像输出设备二原理Confocal利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，來口光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共辄的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计-算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路屮的扫描系统在样品焦平面

4、上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只耍载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。三.激光扫描共焦显微镜的设计特点：1.点照明2.具有照明pinhole和探测pinhole3.照明pinhole和探测pinhole共觇（共焦），共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面4.具有扫描系统一一逐点扫描成像5.具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物例如:LeicaTCSNT的技术指标：1.xy分

5、辨率比传统显微镜小1.4x传统显微镜:Rxy二0.611/NAConfocal:Rxy=0.4l/NA2.样品的最大厚度:大约2mm（10X/0.2物镜）取决于三点：物镜的景深，与NA成反比Z轴的最大移动范围激光的穿透力3.样品的最小光切厚度：大约0.35mm取决于两点：物镜的数值孔径NAZ轴的最小移动步距:40nmZ轴的分辨率:0.35mm1.激光器Kr/Ar激光器：477nm,488nm,568nm,647nmAi■激光器（UV）:361nm激光器的特点：1）方向性好：激光基本眼直线传播2）单色性好l

6、=10-8nm3）髙亮度：激光方向性好,其在空间上的能量分布是高度集屮的4）偏振性：激光为平面偏振光，光纤耦合2.四个荧光通道，一个透射光通道，即除了可同吋采集多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像，但透射光图像为非共焦图像三.共焦显微镜的类型：1•点（慢）扫描共焦显微镜：分辨率高，图像清晰；噪音低；采集图像速度慢；目镜中观察不到共焦图像；2.线（狭缝）扌描共焦显微镜（videorate）:分辨率低；噪音高；扫描速度快240幅/秒；目镜中可观察到共焦图像3.Nipkov转盘式扫描共焦显微镜：性能介于上述

7、两者Z间功能：1.多荧光标记样品的图像釆集2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”3.真正的三维重组4.假三维图的显示5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平而）方向进行光切6.定量分析7.xyt、xzt^xyzt和xt扫描吋间序列扫描&图像处理9.旋转扫描10.区域扫描11.光谱扫描五、激光扫描共焦显微镜技术的应用定位、定量三维重组动态测量*活细胞或组织内游离Ca2+浓度的测量*活细胞内H+浓度（pH值）的测量*自由基的检测*药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量应用：细胞膜电位的测量荧光漂白恢复（FRAP

8、）的测量笼锁解笼锁的测量荧光能暈共振转移(FRET)的测暈其他应用1、定位、定量免疫荧光标记(单标、双标或三标)的定位、定量。如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位细胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI末端原位杂交-fitc+PI荧光原位杂交：染色体基因定位单细胞凝胶电泳GFP的表达游离Ca2+的分布与定量定位、定量研究中常用荧光探针1)Amine-ReactiveProbes与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核背酸耦联的探针，

9、可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等2)FITC(fluorescentisothiocyanate)BODIPYFL503/5123)异硫氤基荧光素494/5184)TRITC四甲基异硫氟基罗丹明544/572BODIPYTMR543/5695)TexasRed徳州红595/615BODIPYTR592/6186)PE藻红蛋白565/5787)cy3490/5308)cy5650/690(1)细胞表面抗原、胞内某种蛋片免