实验碱裂解法小量制备质粒.pptx

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1、碱裂解法小量制备质粒王欢欢二零一二.九质粒plasmid质粒结构非常简单，只能在寄主细胞内独立增殖。质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。F质粒：F因子。使寄主染色体上的基因与其一起转移到受体细胞R质粒：抗药性因子，编码一种或多种抗菌素抗性基因Col质粒：编码有控制大肠杆菌素合成的基因天然质粒的大小在1～200kb不等，但用作载体的质粒通常很小，一般为2～10kb

2、，均以天然质粒为基础，经过人工改造构建而成。大肠杆菌质粒分子结构环形染色体DNAE.coli质粒Plasmid控制质粒DNA转移的基因细菌染色体外能够自我复制的环形双链的DNA分子抗菌素抗性基因专用质粒载体在天然质粒的基础上，进行人工改造和构建的质粒载体，具有各种不同的功能特性。不同的质粒DNA的分子量差异显著，可相差数百倍，有的适于用作基因克隆载体，有的则不适用。低拷贝质粒：1~3份拷贝，“严紧型”stringentplasmid高拷贝质粒：10~60份拷贝“松弛型”relaxedplasmid质粒载体必须具备的条件：具有

3、复制起点具有抗菌素抗性基因具有若干限制酶单一识别位点具有较小的分子量和较高的拷贝数质粒构型从细胞中分离质粒DNA时，质粒DNA通常会呈现超螺旋构型（SC构型），另外也会有开环DNA的存在（OC构型)。在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA具有不同的电泳迁移率，走在前沿的是SC构型，OC构型位于凝胶的最后面，经过限制性核酸内切酶切割质粒之后产生的L构型，其位置则介于SC和OC构型之间质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图A.从细胞中分离的质粒DNAB.经限制性核酸内切酶切割后的线性质粒DNA质粒DNA的分离与纯化应用质粒作为基因克

4、隆的载体分子，重要条件是要获得批量的纯化质粒DNA分子。寄主细胞的裂解是关键，细胞破裂能使质粒DNA分离，但又不污染过多的染色体DNA。氯化铯密度梯度离心法碱变性法微量碱变性法当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。碱裂解法提取大肠杆菌质粒溶液I悬浮--吸取1ml菌液于Eppendorf管中，12000r/min离心1min，弃尽上清。加入100μl冰预冷的solutionI，

5、涡旋振荡30s后置于冰上3min；溶液II裂解—加入200μlsolutionII，快速上下颠倒试管4-5次（切勿振荡），置于冰上3-5min；溶液III沉淀DNA--加入150μl冰预冷的solutionIII，上下小心颠倒5-6次，置于冰上3-5min；抽提酚/氯仿/异戊醇---12000r/min离心5min。取上清（约450μl），加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），混匀；醇沉无水乙醇---12000r/min离心10min。取上清（约400μl），加入2倍体积冰预冷的无水乙醇，-20°C静置2h或O/N

6、；漂洗70%乙醇--12000r/min离心5min，去上清，沉淀用400μl冰预冷70%乙醇洗2-3次，吹干沉淀；溶水RNA酶--加入30μl含0.5URNA酶的ddH2O溶解沉淀，37°C静置30min，-20°C保存。注意要点影响质粒DNA产量的因素：寄主菌株的遗传背景：使用endA基因突变的大肠杆菌寄生菌株，使其失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，增进质粒DNA分子的稳定性质粒的拷贝数及分子大小溶液II要现用现配，NaOH与空气中CO2反应，SDS也会析出加溶液II后菌液澄清，并有拉丝现象，时间不能太长，也不

7、能振荡，避免基因组DNA断裂，要上下颠倒混合。抽提要充分，如有必要可以重复抽提，否则影响酶切等离心养成按顺序放置的习惯，将离心管塑料柄向外，有利于有效溶解看不到的沉淀。醇沉必须充分混合质粒提取试剂盒