RNAi产品使用手册.pdf

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1、THERNAiCOMPANYRNAi产品使用手册上海吉玛制药技术有限公司ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd.1Ⅰ.RNAi简介1A.RNAi实验原理B.RNAi实验流程C.RNAi实验所需试剂D.上海吉玛RNAi相关产品Ⅱ.siRNA设计7A.哺乳动物siRNA设计B.上海吉玛siRNA产品特性C.siRNAoligo技术数据Ⅲ.siRNA对照9A.普通阴性对照B.荧光标记的阴性对照C.siRNA阳性对照D.转染试剂对照E.避免off-target对照Ⅳ.siRNA转染10A.siRNA转染的方法B.RNAi-Mate转染试剂C.RNAi-M

2、ate适用的细胞类型D.转染前细胞培养E.RNAi-Mate：siRNA/DNA比例F.贴壁细胞转染程序G.悬浮细胞siRNA转染程序H.DNA和siRNA共转染细胞程序I.体内siRNA导入方法J.siRNA转染常见问题与建议Ⅴ.mRNA水平RNAi效果监测15A.siRNA细胞转染条件优化B.Real-TimePCRRNAi效果检测C.Real-TimePCR结果分析Ⅵ.蛋白质水平RNAi效果监测20A.western-blot原理B.western-blot操作步骤C.western-blot上样液的制备D.western-blot常用试剂的配制Ⅶ.R

3、NAi实验常见问题解答222Ⅰ.RNAi简介A.RNAi实验原理RNA干扰（RNAinterfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。3B.RNAi

4、实验流程靶基因确认siRNA设计siRNA的制备(TargetGeneIdentification)（siRNADesign）(siRNAGeneration)功能研究RNAi结果检测siRNA的转染（FunctionResearch）(MeasureKnockdown)(siRNATransfection)C.RNAi实验所需试剂试剂种类试剂用途siRNAoligo与您所要敲除靶基因的转录本（mRNA）完全互补转染试剂如脂质体法，lipofectamin2000(invitrogen)，上海吉玛的转染试剂RNAi-Mate，电穿孔法等实验对照包括阴性和阳性

5、及Mockingcontrol基因表达的检测方如mRNA水平检测用qRT-PCR；蛋白表达水平检测用法westernblot4D.上海吉玛RNAi相关产品普通siRNAOligo上海吉玛siRNAOligo是在ISO9000质量标准下生产并经过了反复优化和严格测试；产品质量高度稳定，以退火双链RNA冻干粉的产品形式提交给用户。化学修饰siRNAOligo上海吉玛化学修饰siRNAOligo不仅增强了siRNA在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同时与标准siRNA作用时间相比，上海吉玛化学修饰siRNAOligo的作用时间可延长一倍左右。荧光标记siRNAOl

6、igo荧光标记siRNAoligo可用荧光显微镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等观察到，可直观地观察siRNA转染效率，优化转染条件；荧光标记的siRNAsiRNA还可用于siRNA细胞定位及双标实验（配oligo合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达结合起来。siRNA阴性对照上海吉玛RNAinegativecontrol与哺乳动物基因无同源性，作为实验的阴性对照，同时通过标记荧光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染的效率，有利于优化转染条件。荧光容易拍摄，它有很好的pH耐受性，因而在活细胞中更稳定。siRNA阳性对照上海吉玛

7、RNAipositivecontrol用于确定实验中转染、RNA提取和检测方法的可靠性。上海吉玛提供的阳性对照包括LaminA/C、GFP22、LuciferaseGL2、MAPK1、Beta-Actin、Vimentin、P53、GAPDH、CyclophilinB等。RNAi转染试剂RNAi转染试剂是一种基于脂质的转染试剂，专门用于转染，确保没有RNAse活性，细胞毒性低。适用细胞广泛；可在含有抗生素的完全培养基中转siRNA染；即用型试剂，不必更换培养基，操作简便易行，转染重复性好，可在半小时内完成操作；介导siRNA高转染细胞和体内高效导入，即使在含

8、血清培养基中也能表现高转染效率；4℃下可长期保存。s