高产果胶酶菌株的筛选鉴定及其发酵条件研究_陈勇强.pdf

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1、第14卷第2期中国食品学报Vol．14No．22014年2月JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnologyFeb．2014高产果胶酶菌株的筛选鉴定及其发酵条件研究*陈勇强严芬叶秀云李仁宽陈冬梅林娟（福州大学生物科学与工程学院福州350116）摘要采用观察透明圈与液态发酵测酶活相结合的方法，从腐烂的水果中筛选获得1株果胶酶产生菌G1。通过形态观察与18SrDNA序列分析，鉴定菌株G1为黑曲霉。对G1菌株的发酵工艺进行优化，确定最佳培养基配方（g

2、/L）：桔皮粉32，麸皮10，（NH4）2SO422，Na2HPO4·12H2O8.4，KH2PO41.4，MgSO4·7H2O1.0，CaCl20.1，FeSO4·7H2O0.1，ZnSO4·7H2O0.1，培养基初始pH6.5；最佳发酵条件是：装液量50mL/250mL，转速180r/min，接种量9%（体积分数），32℃培养7d。在此条件下，果胶酶活力达到270.4U/mL，比优化前提高了8.7倍。关键词果胶酶；黑曲霉；筛选鉴定；发酵工艺文章编号1009-7848（2014）02-0138-

3、08果胶酶（pectinase）是指能催化分解果胶质的1材料与方法1类酶的总称，包括原果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、1.1试验材料[1]果胶裂解酶和果胶酯酶等。它在食品工业中应用1.1.1菌种来源于果园土壤与腐烂水果。非常广泛，如果汁澄清，提高果蔬出汁率，改善酒1.1.2主要试剂果胶、半乳糖醛酸，购自Sigma的色泽，增加酒的香气，提取生物活性功能成分，公司；基因组DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、[2-3]茶叶发酵的预处理等。此外，果胶酶在饲料、环250bpDNAmarker，购自TaKaRa公司

4、；其余试剂[4-6]保、纺织、发酵和洗涤等行业也有重要应用价值。均为分析纯级。果胶酶主要来源于微生物的代谢产物，现已发现1.1.3培养基40多种微生物能产果胶酶，有曲霉属、青霉属、镰1）富集培养基（g/L）：果胶2，（NH4）2SO43，[7-9]孢属、克鲁维氏酵母以及某些兼性厌氧细菌等。Na2HPO4·12H2O4.2，KH2PO41.4，FeSO4·7H2O利用微生物发酵生产果胶酶，因具有产能大、0.01，MgSO4·7H2O0.5，pH自然。周期短、质量稳定、经济效益高等优点，故微生物2）筛

5、选培养基：在富集培养基基础上添加是生产果胶酶的优良生物资源。我国是微生物资2%的琼脂。源大国，而目前国内生产的果胶酶酶活不理想，产3）查氏培养基[10]（g/L）：NaNO2，KHPO1，324量小，不能满足国内市场日益增长的需要。筛选果KCl0.5，MgSO4·7H2O0.5，FeSO4·7H2O0.01，蔗糖胶酶高产菌株及优化其发酵产酶的条件，是目前30，琼脂20，pH自然。亟待研究和解决的问题。本文从自然界中筛选果4）马铃薯培养基[10]（g/L）：马铃薯200，葡萄胶酶高产菌株，并对其产酶

6、培养基和发酵条件进糖20，pH自然。固体马铃薯培养基（PDA）加琼脂行研究，以期为果胶酶的发酵生产打下基础。20g。5）基础发酵培养基（g/L）：桔皮粉12，（NH4）2SO410，Na2HPO4·12H2O8.4，KH2PO41.4，MgSO4·7H2O收稿日期：2013-02-241.0，CaCl20.1，FeSO4·7H2O0.1，ZnSO4·7H2O0.1，基金资助：福建省自然科学基金项目（2011J01218）；福建pH自然。省教育厅科技项目（JA10022）1.2试验方法作者简介：陈勇

7、强，男，1986年出生，硕士生1.2.1产果胶酶菌种的筛选初筛：取10g采集通讯作者：林娟样品于90mL无菌生理盐水中振荡30min，制成第14卷第2期高产果胶酶菌株的筛选鉴定及其发酵条件研究139悬液。取悬液1mL于富集培养基中30℃，200r/1.2.3.2菌株分子生物学鉴定以基因组DNAmin培养24h。对培养后的富集液进行梯度稀释，提取试剂盒提取的G1菌株基因组DNA为模板，[13]涂布于筛选培养基中，30℃恒温培养3d，挑取单利用18SrDNA通用引物（上游引物：5′-菌落进行纯化、保藏

8、。同时用卢戈氏碘液对涂布培GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′；下游引物：5′-TC-养后的筛选培养基进行染色，测量菌落直径与透CGCAGGTTCACCTACGGA-3′）进行PCR扩增G1明圈直径。挑选菌落直径与透明圈直径比值（HC菌株的18SrDNA。将PCR扩增产物回收纯化后比值）大的菌株进行复筛。进行序列测定。测序结果拼接后利用Blast工具进复筛：将初筛得到的HC比值较大的菌株接行序列同源性分析，下载部分同源序列通过[14]种于含50mL基础发酵培养基的250mL