利用SSR_ISSR和RAPD技术构建苜蓿基因组DNA指纹图谱.pdf

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1、62-67草　业　学　报第13卷第3期6ö2004ACTAPRATACULTURAESINICAVol.13,No.3利用SSR、ISSR和RAPD技术构建苜蓿基因组DNA指纹图谱魏臻武(甘肃农业大学草业学院,甘肃兰州730070)摘要:在建立可靠的苜蓿基因组DNA提取分离和PCR扩增技术体系的基础上,筛选具有稳定多态性位点的RAPD、SSR和ISSR引物,建立苜蓿基因组DNA的SSR、ISSR和RAPD分子标记技术体系,并利用分子标记检测苜蓿品种(系)的DNA分子标记多态性,构建苜蓿品种的DNA指纹图谱。筛选出36个RAPD引物,8个SSR引物和12

2、个ISSR随机引物,通过PCR扩增在55个国内外苜蓿品种(系)中获得了182个RAPD多态性位点和丰富的SSR和ISSR多态性位点,构建了55个苜蓿品种(系)的SSR、ISSR和RAPD指纹图谱。结果表明,不同苜蓿品种(系)的SSR多态性有较大差异;苜蓿品种ISSR指纹图谱多态性丰富,稳定性比RAPD强;可以通过2～3个引物鉴别我国主要苜蓿品种和引进品种,SSR和ISSR指纹图谱可以更好地用于苜蓿品种鉴定和遗传多样性分析。关键词:苜蓿;分子标记;DNA指纹图谱;SSR;ISSR;RAPD中图分类号:S551.7　　文献标识码:A　　文章编号:10042

3、5759(2004)0320062206X[1]　遗传资源的开发和利用对促进苜蓿生产十分重要,遗传资源的有效利用是农业可持续发展的重要保证。遗传资源搜集、保存和利用都要求对基因源或基因库的多样性进行鉴定。加强苜蓿种质资源研究,对于加快育成优良苜蓿新品种具有重要的作用和意义。[2,3]利用分子标记技术建立DNA指纹图谱(fingerprint)是鉴别品种、品系和选择杂交亲本的有力工具。指纹图谱具有高度的个体或基因型特异性,分辨率高、稳定可靠,能够准确鉴定生物个体和群体之间的差异。以DNA多态性为基础的分子标记,已在种质资源遗传多样性分析、品种指纹图谱及纯

4、度鉴定、作物遗传连锁图谱构建和重要性状的标记定位等方面得到广泛应用。目前用于绘制植物DNA指纹图谱的标记技术主要有RFLP(限制性片段长度多态性,restrictionfragmentlengthpolymorphism)、SSR(简单重复序列,simplesequencerepeat)、AFLP(扩增片段长度多态性,amplifiedfragmentlengthpolymorphism)、RAPD(随机扩增多态性DNA,random2lyamplifiedpolymorphicDNA)及小卫星等。SSR和ISSR(简单重复序列间区,intersimp

5、lesequencerepeat)是第2代基于PCR技术的分子标记技术,以基因组中简单重复序列(SSR)两侧的保守序列为引物,对基因组总DNA进行PCR扩增。和其他DNA分子标记相比,SSR标记具有数量丰富、信息含量高和重复性好等特点,并且[2,4]SSR标记覆盖整个基因组,呈现多基因特点,表现为共显性遗传。此外,SSR分析对DNA的数量和纯度要求不高。ISSR是简单序列重复间区的DNA序列,检测的是基因组中两个SSR之间的一段短的DNA序列上的多态性。利用植物基因组中广泛存在的SSR序列,可以设计出不同植物共用的能够与SSR序列相结合的PCR引物,对

6、两个相距较近、方向相反的SSR序列之间的区段进行扩增。ISSR为随机引物,引物长度在20bps左右,因此可以采用与常规PCR相同的条件,其稳定性比RAPD好。ISSR标记呈典型的孟德尔式遗传,一般表现为显性[5]或共显性。ISSR标记已经在植物遗传和育种中广泛应用。[6][7][8]Brummer等、Echt等和李拥军等利用RFLP和RAPD等分子标记技术对苜蓿DNA的多态性进行了分析。目前尚没有关于苜蓿SSR和ISSR指纹图谱方面的试验报道。本研究的目的是建立苜蓿基因组DNA的RAPD、SSR和ISSR分子标记技术体系。在建立可靠的苜蓿基因组DNA提

7、取分离和PCR扩增技术体系的基础上,筛选具有稳定的多态性位点的RAPD、SSR和ISSR引物,检测苜蓿品种(系)的DNA分子标记多态性,构建苜蓿品种的DNA指纹图谱。X收稿日期:2003206216基金项目:教育部西部高等学校高级访问学者基金;中澳苜蓿项目(ASIö1998ö026);“十五”国家奶业重大科技专项(2002BA518A03)资助。作者简介:魏臻武(19662),男,青海西宁人,副教授,博士。E2mail:weizhenwumail@263.net第13卷第3期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　草业学报2004年　　　　　　　　　　

8、　　　　　　　　　　631材料与方法1.1试验材料55个苜蓿种质来自不同的国家和地区,于200