乙型肝炎表面抗原单克隆抗体的制备及其应用.pdf

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1、中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１）：７０～７５殏檪檪檪檪檪檪檪檪殏檪檪研究简报檪檪殏檪檪檪檪檪檪檪檪殏乙型肝炎表面抗原单克隆抗体的制备及其应用１１２１１柴智罗旭光徐钧张悦红解军（１山西医科大学生物化学与分子生物学教研室太原０３０００１２山西省人民医院普外科太原０３００１２）摘要目的：研制能够同时检测乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）野生株和多种变异株的单克隆抗体（ｍＡｂ），将筛选出的ｍＡｂ进行纯度、免疫学性状鉴定，并对其应用效果及质量做初步评价。方法：用中国乙型肝炎病毒感染者血清中分离的ＨＢｓＡｇ免疫小鼠，利用杂交瘤细胞融合技术

2、制备抗ＨＢｓＡｇ野生株和多种变异株的ｍＡｂ，将筛选出的ｍＡｂ经饱和硫酸铵纯化后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、ＥＬＩＳＡ鉴定其纯度、特性，初步评价其应用效果及质量。结果：获得了一株能够同时检测ＨＢｓＡｇ野生株和多种变异株的ｍＡｂ，命名为Ｄ１２。其纯度较高，特异性强，灵敏度好，Ｉｇ亚类测定结果为ＩｇＧ１，识别位点存在于自然抗原上，其检测ＨＢｓＡｇ野生株的能力优于现行３种国产试剂盒，检测ＨＢｓＡｇ变异株的能力明显优于现行５种国产试剂盒。结论：成功研制了可以同时识别ＨＢｓＡｇ野生株和大多数变异株的ｍＡｂ，为进一步提高我国当前乙型肝炎病毒变异株的检出率以及加强预防和控制

3、乙型肝炎病毒的传播奠定新的基础。关键词乙型肝炎病毒乙型肝炎表面抗原单克隆抗体ＥＬＩＳＡ中图分类号Ｒ３７３．２乙型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ，ＨＢ）是危害十分严重的重的抗原表位，完全有可能应用基因重组变异株表面抗大传染病之一。目前，全世界大约有３．５亿人受到乙原研制出识别变异的特异单抗，从而发展能够检测变型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ，ＨＢＶ）的感染；在我国，绝异株表面抗原的特异性快速免疫诊断方法。大多数终末期肝病患者均由于感染ＨＢＶ而引起，每年本研究在成功建立ＨＢｓＡｇＥＬＩＳＡ诊断试剂基础模导致大约１００万人死亡。ＨＢＶ基因变异是乙肝防治所式的基础上，通过

4、一系列的实验方法筛选出能同时与面临的新问题［１］。研究表明［２］，Ｓ基因变异株与野生株野生型和突变型乙肝病毒表面抗原进行特异性结合反一样具有致病力和传播能力，但变异株与野生株表面应的单克隆抗体，作为快速诊断ＨＢｓＡｇＥＬＩＳＡ试剂盒抗原在立体构型和抗原表位组成上有明显的差异。国的生物原料，进一步提高变异株的检出率，为深入开展ＨＢＶ变异株的诊断、预防和控制奠定了基础。内外现行表面抗原诊断试剂对突变体极易出现漏检，由于缺乏Ｓ基因变异株特异的快速检测技术，很难开１材料和方法展Ｓ基因变异株感染和流行的诊断、检测、预防控制和１．１材料研究工作。因此，开发快速检测表面抗原变异株的免

5、１．１．１ＨＢｓＡｇ变异株与质粒１５个常见变异ＨＢｓＡｇ疫学诊断方法对于乙肝的预防和控制具有重要意义。［３］样品（Ｂ１Ｂ１５）由本课题组构建的分别表达１５个变异实验研究同时显示：变异株表面抗原具有某些特异表面抗原位点的真核表达质粒转染对数生长期的收稿日期：２００７１１０２修回日期：２００７１２０２ＨｕＨ６细胞，培养细胞收集上清液所得。１５个真核表达国家自然科学基金（３０５７２２１３），山西省科技攻关（０５１１００４），山西省自然科学基金（２００６０１１１０７），资助项目质粒由本课题组制备。通讯作者，电子信箱：ｘｉｅｊｕｎｔｙ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ１．１．

6、２主要试剂酶标反应板购自深圳金灿华实业２００８，２８（１）柴智等：乙型肝炎表面抗原单克隆抗体的制备及其应用７１公司；乙型肝炎表面抗原国家参比品购自中国药品生已建立的ＨＢｓＡｇ诊断试剂的基础模式检测其特异性。物制品检定所；ＨＢｓＡｇ阳性血浆由太原市红十字血液（２）单抗Ｄ１２Ｉｇ亚类测定经过纯化后的单抗中心提供；ＨＢｓＡｂＥＬＩＳＡ诊断试剂盒购自上海实业科Ｄ１２用ＰＢＳ稀释后与ＰＢＳ稀释的兔抗鼠分型血清在华生物有限公司，比对ＨＢｓＡｇＥＬＩＳＡ诊断试剂盒购自１％的琼脂糖中作免疫双扩散，２４ｈ后观察沉淀线。上海、厦门、北京、河南等５个生产厂家（Ｃ１～Ｃ５代（３）单抗Ｄ１２识别

7、自然抗原位点的分析用上海表）；ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０购自北京中国典实业科华生物有限公司表面抗原包被９６孔板，检测２７型培养物保存中心；ＨＢｓＡｇ化学发光定量检测试剂盒份表面抗体阳性病人血清４５０ｎｍＯＤ值。以单抗腹水购自ＡＢＢＯＴＴ公司；纯化ＨＢｓＡｇ购自厦门生物技术公对同一ＨＲＰ标记的单抗抑制为１００％，以已知单抗对司；正常人阴性血清购自深圳生物材料公司。标记单抗的抑制为阴性对照，计算抑制率。抑制率表１．１．３仪器、设备ＺＭＸ９８８Ｂ型全自动酶标洗板机、示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程自动包板机和ＳＭ３型自