过表达工具经验分享.pdf

《过表达工具经验分享.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、过表达工具经验分享By季博手上有篇关于lncRNA研究的cell文章，一位兄弟要求我分析下。刚从网上把全文搞下来了，看了下，思路清晰，没有啥需要另外需要学习的内容，应该花不了多少时间用来分析，老毛病就犯了。放到一边去了，先歇歇，呵呵。今天是周末，看了4份项目，休息下总可以吧。不过，休息的时候看到QQ群上大家对过表达的问题在纠结。想想，分析高分文章，高大上，对大家是有帮助。但对于这些工具的了解，其实也不可小视。手就痒了。对于研究，其实工具很重要。古语云“工欲善其事，必先利其器”。意思应该中国人都懂吧，除了“香蕉”外（不知道香

2、蕉啥意思？外黄内白）。基因的操作，其实就两个方向，overexpress，和knockdown（程度大点就是knockout，不是季博卖弄英文，这里用英文表述得更清晰些）。Knockdown今天不讨论。就讨论过表达。过表达，就是把基因上调表达，高于原本天然的表达量。方法，1、外源构建目的基因的CDS区，使用外源启动子表达外源构建的目的基因。这个是最常用的方法，今天就讨论这个。2、上调目的基因的激活型转录因子，从而使得基因上调表达。怎么上调目的基因的激活型转录因子呢，呵呵。一个是参考1中的外源构建。一个是用药物刺激（这里的药

3、物可以是化合物，也可以是蛋白等等。比如免疫中常用的LPS也算一个。这次刺激可以是上调基因，其实也可以用来抑制。）。前面比较热的TALEN技术，大家了解比较多的是用来编辑DNA，其实也可以用来上调基因，把TALE后面不要接DNA酶，接转录因子激活元件，且序列让他识别启动子区。那么就做成人工的转录激活因子了。Sigh，又开始扯了。还是回到我们的主题吧。外源构建目的基因。其实，这个工具，一开始，只需要考虑两个地方。1、什么启动子。2、基因CDS区。1、先说启动子。这个是看过表达工具在什么地方用。是原核表达呢，还是真核表达，表达的

4、环境是什么物种。是否需要受诱导。等等。要是不需要表达，T载体就OK了。这里说几个事情，季博以前也弱过（现在其实也很弱）。啥事呢，在microRNA刚兴起的时候，季博搞不懂用啥启动子来研究的。就问国外的一个教授，教授回答，“与常规过表达有区别吗？”再问：“常规是蛋白编码基因，需要翻译的，microRNA不需要翻译，没有特殊要求吗？”答：“啊，你认为基因表达的过程中，翻译过程会影响转录过程？”额，不知道，至少现在没有人说过。呵呵。意思是啥呢，基因表达的两个过程，转录和翻译。启动子只是把后面的片段转录出来，后续的翻译过程启动子控

5、制不了。（有人不了解？跟本科生借本遗传学仔细复习下。）有人需要组织特异表达基因，这个在哪里控制呢，就是启动子。使用组织特异的启动子就OK了。其实组织特异的敲除也是使用这个原理，把CRE酶放在组织特异的启动子后面就OK了。（CREloxp系统，不清楚的度下吧。季博就不多扯了。避免有人扔砖头）。还有就是可诱导，使用可诱导启动子。比如teton启动子。所以，根据研究目的的不同，寻找合适的启动子。这些启动子，基本上都有相应商业化的载体。如果没有，就自己改建吧。2、启动子确定了。下面就是基因了。很多人说，这个简单呀。到NCBI上查下

6、，不就OK了吗。是的呀。不过还是有很多细节需要注意的。多转录本。一个基因如果有多个转录本，那么我做哪个呢。季博也不知道，前面有个兄弟给了个很好的方法，用不同转录本的NM号及研究的内容到NCBI上查，看哪个NM号文章最多，就用哪个。呵呵。虽然这个方法跟那位兄弟一样比较粗暴，但确实是个好办法（希望老徐看不见这段，哈哈）。当然，如果你知道你的研究方向，别人用的是哪个。哪怕文章少，也得用。特殊定位蛋白。比如，分泌蛋白。需要有分泌肽。如果研究其功能是分泌出来行使的呢，还是在细胞内行使的。可以把他的分泌肽去掉，看功能。注意，这个研究方

7、案建议做分泌蛋白和其他特殊定位蛋白的筒子们都做做。把研究做得越细，越有水平。（另外，分泌蛋白，不是说细胞内就没有了，其实蛋白表达都在细胞内进行，细胞内都有的。呵呵。）说了这么多，那么问题来了，是不是启动子确定了，CDS也确定了。就OK了呢。呵呵，如果OK，季博就不用写这个日志了。以前带师弟师妹，帮别人分析问题，大道至简，对于过表达构建，季博就抓两个地方，1、构建序列正确。2、外源tag抗体检测有外源条带。（季博其实比较笨，老师说了，笨鸟先飞，所以季博就在飞上下功夫。练就了一手分析的本领。不管啥问题，总能扯出个123的道理来

8、，呵呵。其实吧，这是吹的。季博的经验是从别人那里获得的。帮人就是帮己。帮10个人，就有10个问题解决的经验了，帮得人越多，经验值越高，就可以打大怪了。）1、序列。其实，过表达构建，我们能够控制的就是构建的序列。WB发现有问题，第一时间就是看测序结果中，序列是否OK。如果OK。再往下分析。2、外源tag抗