诺禾致源有参转录组分析流程.pdf

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1、NHXXXXXX_species转录组生物信息分析结题报告建库测序流程TotalRNA样品检测文库构建库检上机测序生物信息分析流程结果展示及说明原始序列数据测序数据质量评估参考序列比对分析可变剪切分析新转录本预测SNP和InDel分析基因表达水平分析RNA-seq整体质量评估基因差异表达分析差异基因GO富集分析差异基因KEGG富集分析差异基因蛋白互作网络分析参考文献附录文件目录列表软件列表Methods英文版备注1/49北京诺禾致源生物信息科技有限公司一、建库测序流程从RNA样品到最终数据获得，样品检测、建库、测序每一个

2、环节都会对数据质量和数量产生影响，而数据质量又会直接影响后续信息分析的结果。为了从源头上保证测序数据的准确性、可靠性，诺禾致源对样品检测、建库、测序每一个生产步骤都严格把控，从根本上确保了高质量数据的产出。流程图如下：2/49北京诺禾致源生物信息科技有限公司1TotalRNA样品检测诺禾致源对RNA样品的检测主要包括4种方法：(1)琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染(2)Nanodrop检测RNA的纯度（OD260/280比值）(3)Qubit对RNA浓度进行精确定量(4)Agilent2100精确检测RNA

3、的完整性2文库构建样品检测合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则通过试剂盒去除rRNA来富集mRNA）。随后加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（randomhexamers）合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNApolymeraseI合成二链cDNA，随后利用AMPureXPbeads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXPbeads进行片段大小选择

4、，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。构建原理图如下：3库检文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent2100对文库的insertsize进行检测，insertsize符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞2nM），以保证文库质量。4上机测序库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行HiSeq/MiSeq测序。3/49北京诺禾致源生物信息科技有限公司二、生物信息分析流程获得原始测序序列(Se

5、quencedReads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析：其中，DEU分析仅针对有生物学重复样品，若样品无生物学重复，则不进行此项分析。对于蛋白互作网络分析，若其存在于合同信息分析内容中，而且选择了相应的分析物种或者近缘物种，则进行此项分析；若不存在，则不进行。4/49北京诺禾致源生物信息科技有限公司三、结果展示及说明1原始序列数据高通量测序(如IlluminaHiSeqTM2500/MiseqTM)得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别(BaseCalling)分析转化

6、为原始测序序列（SequencedReads），我们称之为RawData或RawReads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列（reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息。FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下：@HWI-ST1276:71:C1162ACXX:1:1101:1208:24581:N:0:CGATGTNAAGAACACGTTCGGTCACCTCAGCACACTTGTGAATGTCATGGGATCCAT+#55???BBBBB?BA@DEEFFCFFHHFFCFFHH

7、HHHHHFAE0ECFFD/AEHH其中第一行以“@”开头，随后为Illumina测序标识符(SequenceIdentifiers)和描述文字(选择性部分)；第二行是碱基序列；第三行以“+”开头，随后为Illumina测序标识符(选择性部分)；第四行是对应碱基的测序质量，该行中每个字符对应的ASCII值减去33，即为对应第二行碱基的测序质量值。Illumina测序标识符详细信息如下：HWI-ST1276Instrument–uniqueidentifierofthesequencer71runnumber–Runnu

8、mberoninstrumentC1162ACXXFlowCellID–IDofflowcell1LaneNumber–positiveinteger1101TileNumber–positiveinteger1208X–xcoordinateofthespot.Integerwhichcanbenegative24