早期糖尿病大鼠视网膜中tsp—1和vegf的动态变化及意义.doc

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1、早期糖尿病大鼠视网膜中TSP—1和VEGF的动态变化及意义【摘要】目的检测血小板反应蛋白T(TSP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)在糖尿病大鼠视网膜中的表达情况。方法采用链腺佐菌素(STZ)诱导10只大鼠糖尿病模型，另取10只正常大鼠作为正常对照组，免疫组织化学方法检测TSP-1和VEGF蛋白质在人鼠视网膜的表达情况。结果糖尿病组大鼠视网膜TSP-1阳性表达较正常对照组降低(PC0.01)。糖尿病3个月时，VEGF在视网膜的阳性表达高于正常对照组(1X0.05)。结论TSP-1低表达和VEGF过表达之间的不平衡可能在早期糖尿病视网膜病

2、变过程中起到调控作用。【关键词】糖尿病视网膜病变；免疫组织化学；血小板反应蛋白T;血管内皮生长因子糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)是糖尿病严重的微血管并发症之一，是导致双眼不可逆性盲的重要原因，其发病机制比较复杂，受多种血管刺激因子和抑制因子调控。英中血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是目前发现的作用较强的眼部新生血管抑制因子和促进因子。作者用免疫组织化学方法检测TSP-1和VEGF

3、蛋白质在大鼠模型中的表达及变化，以希望对早期DR的发病机制有进一步的了解。1材料与方法1.1实验动物分组及模型建立实验用封闭群雄性Wistar大鼠40只,体质量200〜260g,将链腺佐菌素（streptozotocin,STZ；Sigma公司）按60mg•kg-1腹腔内注射，注射后48h检测尿糖和血糖。血糖浓度达16.65mmol-L-1,尿糖达+++以上为模型建立成功。成模后每月检测一次鼠尾血糖。实验组10只，另取正常对照组10只。正常组大鼠腹腔注射0.lmol•L-1柠檬酸缓冲液。1.2眼球标本的取材和制片各组大鼠3个月时以10%水

4、合氯醛腹腔麻醉。麻醉成功后灌注多聚甲醛约300mlo摘除眼球，浸泡固定24ho常规浸蜡，包埋，备用。将制好的眼球标本切片，用于免疫组织化学染色。1.3各组大鼠视网膜TSP-1和VEGF表达的检测采用免疫组织化学SP-9002法，小鼠抗大鼠TSP-1单克隆抗体购自美国NeoMarkers公司，VEGF单克隆抗体、SP-9002免疫组织化学试剂盒及显色试剂盒购于中山生物工程有限公司。操作步骤为「切片脱蜡至水；体积分数3%H202滴加切片上，室温孵育15min；微波修复抗原15min,滴加正常山羊血清封闭非特异性抗原15min；滴加TSP-1-

5、抗（稀释度为1：100）或VEGF-抗（稀释度为1：300）,4°C过夜；生物素化二抗工作液15min；辣根酶标记链霉素卵白素工作液15min,DAB显色，复染，脱水，透明，封固镜检。阴性对照实验以磷酸缓冲液代替一抗。1.4统计学方法采用Image-PmPlus图像分析系统测定视网膜TSP-1和VEGF的积分光密度，数据以x-±s表示，采用SPSS13.0统计学软件进行t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组TSP-1免疫组织化学染色结果光镜观察正常组屮TSP-1蛋白质的阳性反应表达分布于视网膜的内界膜、内从状层、内核层

6、、外从状层，呈深棕黄色；糖尿病大鼠视网膜TSP-1蛋白质的阳性表达较正常组显著降低，尤其在内丛状层、外丛状层呈极微弱的阳性表达见表1。2.2各组VEGF免疫组织化学染色结果光镜观察正常组大鼠VEGF阳性反应在视网膜分布于内核层及节细胞层，胞浆呈棕黄色，胞核未显色。糖尿病组人鼠视网膜中VEGF蛋白质的阳性表达分布于内核层及节细胞层，表达增强，胞浆呈深棕黄色，内核层阳性反应细胞增多，见表lo3讨论糖尿病视网膜病变(DR)是常见致盲性疾病，基本病理过程表现为微循环障碍，主耍病理改变为视网膜血管渗透性增加，从而促进视网膜缺血缺氧及新生血管形成，最

7、终导致视功能损害［1］。近年来的研究表明，其中血小板反应蛋白-1(TSP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)是重要的眼部新生血管抑制因子和促进因子，它们在眼底新生血管生成过程中起着重要作用［2］。TSP-1是可由多种细胞分泌的抗新生血管因子，是一种重耍的多肽类内源性血管新生抑制物［3］。TSP-1还可与细胞表面受体、蛋白酶、及细胞外基质发生作用，可刺激细胞增生，并参与胚胎发育、组织分化、细胞迁移、血管生成、炎症以及凝血与纤溶等病理生理过程，其已被公认为一种有效的内源性血管生成抑制因子，它可诱导内皮细胞凋亡，这种抑制作用可被抗TSP-1的单

8、克隆抗体所中和，并在氧诱导的缺血性视网膜病变过程中起关键作用，视网膜前新生血管减弱与TSP-1的表达增加有关［4］,研究发现在老年性黄斑病变屮Bruch's膜和脉络膜屮TSP-1的降低可能会促