细胞因子与黏附分子检测.pptx

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1、临床免疫学检验技术第十六章细胞因子与黏附分子检测郑晓群目录第一节概述第二节临床常用的测定方法第三节细胞因子与黏附分子测定的临床应用第一节概述重点提示细胞因子与黏附分子概念细胞因子的作用特点细胞因子的生物学功能黏附分子的生物学功能概念细胞因子（cytokine）是由免疫细胞及组织细胞表达并分泌的，在细胞间发挥相互调控作用的一类小分子蛋白质或多肽，通过与细胞表面相应受体的结合发挥生物学效应。概念黏附分子（adhesionmolecules，AM）是由细胞产生、介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互结合的分子，以受

2、体-配体结合的形式发挥作用。一、细胞因子及其受体的特性与功能白细胞介素（interleukin，IL）干扰素（interferon，IFN）集落刺激因子（colonystimulatingfactor，CSF）肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）生长因子（growthfactor，GF)趋化因子（chemokine）细胞因子的种类一、细胞因子及其受体的特性与功能低分子量的多肽或糖蛋白，大部分为单体，半衰期短。具有高效性、多效性、重叠性、网络性、协同性和拮抗性。细胞因子的特性一、细

3、胞因子及其受体的特性与功能参与调控免疫细胞的发育、分化和功能。参与调控机体的免疫应答。参与体内免疫调节网络等作用。细胞因子生物学功能一、细胞因子及其受体的特性与功能细胞因子与相应受体结合后发挥效应。由胞外区、跨膜区和胞内区三部分构成。组织反应性：受体的分布及密度。膜型受体与可溶型受体。细胞因子受体的共同特性二、黏附分子的特性与功能选择素家族(selectinfamily)钙黏素家族(cadherinfamily)整合素家族（integrinfamily)免疫球蛋白超家族（Immunogolobulinsu

4、perfamily,IgSF)分类二、黏附分子的特性与功能缺少跨膜和胞内部分，分子量小。可直接分泌到血液和其他体液。具有黏附分子的结合活性。其水平的增高程度与疾病相关：脓毒血症：可溶性E-选择素，升高20倍～23倍。HIV感染：可溶性L-选择素，升高2倍～3倍。可溶型黏附分子二、黏附分子的特性与功能参与免疫细胞的分化和发育参与免疫应答和炎症反应参与伤口愈合、血栓形成淋巴细胞的归巢参与调节细胞凋亡生物学功能第二节临床常用的测定方法重点提示基本方法方法学评价注意事项检测水平基因水平：分子生物学法蛋白水平活性：

5、生物学方法含量：免疫学测定法一、酶联免疫吸附试验夹心法ELISA：一步法和两步法单克隆抗体或多克隆抗体用于细胞因子检测可溶型细胞因子受体或黏附分子检测首选方法基本方法一、酶联免疫吸附试验特异、简便成本低、易于推广可大批量同时检测且废弃物便于处理敏感性偏低不能判断细胞因子的生物学活性优点缺点一、酶联免疫吸附试验检测标本：建议采用血浆（肝素或EDTA抗凝血）检测条件：适时、适当刺激剂、检测时点干扰因素：标本严重溶血、污染、分泌与降解注意事项二、化学发光酶免疫试验CLEIA：双抗体夹心法自动化分析体液中细胞因子

6、或可溶型细胞因子受体的定量基本方法二、化学发光酶免疫试验特异性好、灵敏度高、线性范围宽试剂稳定，可自动化检测缺点是不能区分细胞因子的生物学活性方法学评价三、流式细胞术基于荧光抗体染色技术并利用流式细胞仪高分辨力所建立的方法。单个细胞水平的检测。用于细胞内细胞因子、细胞表面黏附分子和细胞因子受体的检测。基本方法三、流式细胞术基本步骤1．分离和培养待检细胞2．细胞破膜与固定3．封闭非特异性结合位点4．染色与分析三、流式细胞术区分不同分泌特性的细胞亚群：Th1细胞IFN-γTh2细胞IL-4细胞表面的黏附分子或

7、细胞因子受体：直接或间接荧光抗体染色无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭三、流式细胞术具有特异、高效、灵敏等特点，进行多参数相关分析接近生物体的分析条件，更准确反映体内状况。缺点是流式细胞仪较昂贵，不易普及使用。方法学评价三、流式细胞术标本处理：活细胞，保持良好状态对照选择：未刺激对照、激活对照、同型对照荧光素选择：低表达---PE、APC高表达---FITC注意事项四、酶联免疫斑点实验基本方法ELISPOT每个斑点代表单个分泌待测细胞因子的细胞。斑点颜色深浅与细胞分泌细胞因子的含量相关。四、酶联免疫斑

8、点实验优于传统分泌细胞的检测类似于体内的实验环境比常规ELISA法的灵敏度高200倍引入生物素与亲合素放大系统，可大大提高灵敏度方法学评价四、酶联免疫斑点实验选用的底物应在反应后形成不溶性产物抗体：高亲和力、高特异性、低内毒素的特点同时检测两种细胞因子，如IL-2和IL-4结核感染T细胞斑点试验注意事项五、免疫学测定方法学评价影响因素较少，特异性高操作简便、快速，易于推广大部分细胞因子均有商品化试剂盒，方便检测重复性好，实验结