小鼠骨髓染色体的制备和观察公共格的.pptx

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1、小鼠骨髓染色体制备及观察毒理学实验11曾涛山东大学环境与健康系毒理学教研室1、实验目的与要求了解小鼠骨髓染色体畸变的意义；掌握小鼠骨髓细胞染色体标本的制备方法观察小鼠染色体的形态特征和染色体数目许多化学毒物具有遗传毒性基因突变：碱基置换和移码突变。染色体畸变（structuralchromosomeaberration)：是指由于染色体或染色单体断裂，造成染色体或染色单体缺失或引起各种重排，从而出现染色体结构异常颜色体数目异常：整倍性和非整倍性改变。染色体损伤的类型：染色体数目的改变非整倍体：亚二倍体或超二倍体。整倍性改变：染

2、色体成倍增加。染色体结构的改变断裂和裂隙：微小体；较断片小而呈圆形。有着丝点环：带有着丝点部分，两端形成环状结构并伴有一双无着丝点断片。无着丝点环：成环状结构。插入/重复8非特定性型变化：如粉碎化、着丝点细长化、粘着等整倍性畸变非整倍性畸变如何评价化合物的遗传毒性？鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）：是最常用的检查基因突变的方法。检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力评价染色体损伤的试验方法包括：常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验体外培养细胞或者体

3、内染色体畸变试验2、实验原理有丝分裂：真核细胞的染色质凝集成染色体，复制的姐妹染色单体在纺锤丝的牵拉下分向细胞的两极，从而产生两个染色体数目和遗传性相同的子细胞的一种细胞分裂的类型。细胞周期：从一次有丝分裂完成时开始，到下一次有丝分裂结束时为止，成为一个细胞周期。间期：G1期，DNA合成前期；S期，DNA合成期；DNA经过复制，含量增加一倍，细胞成为4倍体。G2期，DNA合成后期。分裂期：前期：染色质浓缩形成染色体；中心体向细胞两极移动，纺锤体出现。中期：核膜核仁消失，染色体排列于细胞的赤道平面上，从纺锤体发出微管附着于染色体

4、的着丝粒上。后期：姐妹染色单体分离末期：染色体解螺旋，重新出现核膜核仁，细胞一分为二G1：从有丝分裂结束到DNA复制之前；S:DNA合成；G2：DNA复制结束到有丝分裂开始；M：有丝分裂期增殖群细胞，细胞始终保持分裂能力，持续进入分裂循环；不再增殖细胞，比如神经细胞；暂不增殖细胞，比如肝脏细胞。秋水仙素，又称秋水仙碱，能与微管蛋白二聚体结合，破坏纺锤体的形成，使染色体停滞在分裂中期。本实验所用的小鼠骨髓细胞具有高度的分裂活性并且数量非常多,经秋水仙素处理后,可使分裂的细胞阻断在有丝分裂中期,再经低渗、固定、滴片染色等处理,便可

5、制作较好的小鼠骨髓细胞染色体标本。3、实验材料实验动物：健康雄性昆明种小鼠试剂0.1％秋水仙素：称10mg秋水仙素，溶于10mL生理盐水中。0.075M的KCl低渗溶液：称5.59克KCl溶于1,000mL蒸馏水中。2.2%柠檬酸钠溶液：称取22g柠檬酸钠溶解于1000ml蒸馏水中。实验器材恒温培养箱、普通离心机、显微镜、分析天平、架盘天平、离心管(5～10mL)、吸管注射器(5mL)、100mL烧杯、载玻片4、实验步骤秋水仙素(4mg/kgbw)腹腔注射脱臼处死小鼠，分离股骨，去附着肌肉，剪去两端骨骺，用5ml注射器吸取4m

6、l柠檬酸钠溶液将骨髓冲入10ml离心管中；反复冲洗，直至股断面由红色变为白色。低渗，1500rpm×10min，弃上清，加入4mL0.075M的KCl，37℃放置20min。固定，1000rpm×10min，沉淀中加入甲醇/冰醋酸(3:1)固定20min;1500rpm×10min，沉淀中加入甲醇/冰醋酸(1:1)固定20min；1000rpm离心10min，留取上清液，用吸管混匀制备细胞悬浮液；滴片。将洗净的载玻片从冰水中取出，立即吸取细胞悬液在玻片的1/3处滴2-3滴，轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上。空气干燥染色:Giems

7、a应用液染色15min。水洗显微镜观察结果345时，如不能将沉淀打散吹均匀的话，会使得最终制片后细胞核过于密集。5、实验结果在显微镜下可观察到染色体被Giemsa应用液染为紫红色或桃红色。小鼠染色体数目2n=40。在低倍镜下可见较多的圆形的间期细胞核。寻找染色体分散良好的中期分裂相，移至视野中央，然后用油镜观察。在油镜下，可见40条清晰的染色体。端着丝粒染色体6.注意事项秋水仙素的注射剂量与时间对观察中期染色体的形态影响很大。通常情况下，小鼠按4μg/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，3～4h后处死小鼠，此时观察中期染色体特征明

8、显。注射时间过短或过长，在镜下可见间期细胞多，而中期染色体形态少。如果在显微镜下能观察到50%～80%中期染色体，说明试验操作相当成功。由于小鼠的股骨较细，因此应细心地剥去皮肤，然后用手术剪剪去两端骨骺，用装有2％柠檬酸钠溶液的注射器针小心插入骨髓腔将溶液注射完毕，并反复从两