资源描述：
《脊髓灰质炎病毒sabin株工作种子批基因鉴别.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、(376(中国生物制品学杂志2006年7月第19卷第4期ChinJBiologicalsJuly2006,Vo1.19No.4预防制品脊髓灰质炎病毒Sabin株工作种子批基因鉴别廖国阳孙明波余芬沈伟赵玮蒋燕军姜述德摘要目的研究脊髓灰质炎病毒Sabin株基因鉴别的方法。方法分别进行脊髓灰质炎病毒!、∀型Sabin株和#型Pfizer株3个型的工作种子批病毒RTPCR,对扩增产物进行SDSPAGE及测序。结果!、∀型Sabin株和#型Pfizer株3个型的工作种子批病毒分别出现了97、71
2、和53bp的电泳带,与预期结果相符。扩增基因序列与报道的脊髓灰质炎病毒减毒株序列一致。结论RTPCR可以用于脊髓灰质炎病毒Sabin株毒株鉴别。关键词脊髓灰质炎病毒;基因鉴别;RTPCR脊髓灰质炎病毒分为!、∀、#三个血清型,每Hep2细胞(美国菌种保存中心提供),置(36%1)&个血清型各毒株的毒力亦有所不同。脊髓灰质炎病下培养,7d判定结果。同时设病毒参考品对照。毒是一种正链RNA病毒,受宿主细胞环境等因素影5鉴别试验响,易发生突变,导致毒力的改变。为探索脊髓灰质取!、∀、#型单价
3、抗血清,与等量相应型别的炎病毒Sabin株工作种子批的分子生物学鉴定方病毒样品混合,置(36%1)&中和1h,接种Hep2法,本文对Sabin株基因型进行了鉴别。细胞,置(36%1)&下培养,7d判定结果,应不发生病变。同时设血清对照和细胞对照,结果均应为阴材料与方法性。病毒对照结果应为阳性。1毒株6病毒RNA的提取、基因扩增及克隆病毒主种子批为WHOType1SabinseedSO+用QiagenQIAamp病毒RNA小量提取试剂盒1,WHOType2SabinseedSO+1和WHOTy
4、pe3提取RNA。再用QiagenOneStepRTPCR试剂盒扩457PfizerRSO1。由病毒主种子批在微载体培养的增型特异性基因。反应体系:H2O235,l5∋buffVero细胞上制备出工作种子批:!型Sabin株SO+er10,ldNTP2,lEnzyme2,lRNasin05,l病2,批号UPV9102;∀型Sabin株SO+2,批号毒RNA提取物10,l正链引物1,l负链引物1。lUPV9103#型;Pfizer株RSO2,批号UVP9501。RT反
5、应:50&30min,95&15min。PCR循环:2试剂95&45s,55&45s,72&45s,30个循环后,72&延病毒RNA小量提取试剂盒和OneStepRTPCR伸10min。采用20%的琼脂糖凝胶和10%聚丙烯试剂盒,购自美国Qiagen公司。酰胺凝胶电泳,溴乙锭溶液(1g/ml)染色分析扩3引物增产物,并进一步将其克隆到T载体[宝生物工程!F:5∃TCCACTGGCTTCAGTGTT3∃,(大连)公司]中,DNA测序鉴定基因序列。!R:5∃AGGTCAGATGC
6、TTGAAAGC3∃;∀F:5∃CGGCTTTGTGTCAGGC3∃,结果∀R:5∃CCGTTGAAGGGATTACTAAA3∃;1脊髓灰质炎病毒Sabin株工作种子批型别#F:5∃AGTATCAGGTAAGCTATCC3∃,鉴定#R:5∃AGGGCGCCCTAACTTTG3∃。病毒感染性滴度检测结果,脊髓灰质炎病毒Sa由宝生物工程(大连)公司合成。bin株工作种子批!型为862LogCCID50/m,l∀型[1]4病毒滴定为812LogCCID50/m,l#型
7、为787LogCCID50/m。l取样品作10倍系列稀释,每稀释度病毒液接种用交叉中和试验检测脊髓灰质炎病毒Sabin株工作种子批,能被同型抗脊髓灰质炎病毒血清中和,基金项目:云南省科技厅新药专项基金资助项目(2000XY05).作者单位:中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研而不能被其它型血清中和,可确定3个批号的毒种究所IPV课题组(昆明650118).的型别:UPV9102为!型,UPV9103为∀型,UVP通讯作者:姜述德,Te:l08718334551,Emai:ljsd@
8、163.com9501为#型,见表1。中国生物制品学杂志2006年7月第19卷第4期ChinJBiologicalsJuly2006,Vo1.19No.4(377(表1脊髓灰质炎病毒Sabin株工作种子批中和试验型别鉴TTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGC定结果CGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAAT抗血清病毒细胞GAGTGA批号!型∀型#型三价阴性对照对照下划线部分为插入片段序列。将脊髓灰质炎病UPV9102-+
