彗星电泳方法整理.docx

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1、Cometassay简介单细胞凝胶电泳技术（Singlecellgelelectrophoresis,SCGE），又称彗星试验（Cometassay），是在核酸沉淀法（Nucleoidsedimentation）和晕圈分析（Holoassay）等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的新技术。它主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。是碱性单

2、细胞凝胶电泳可以检测DNA链的断裂和碱不稳定点，请问碱不稳定点是不是DNA上的脱嘌呤/嘧啶位点呀？还有个问题就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果，而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复，因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂，所以彗星试验所反映的时间－效应关系，可能并非与真实的DNA损伤有偏差，因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。SCGE技术的原理：细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且

3、不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA残留而形成类核。如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测量彗星

4、尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更准确。目前，用于SCGE分析的指标主要分为四类，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。其中形状指标有彗星细胞率；距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径；强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等；矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。依靠目镜测微尺人工测量彗星距离指标，主观性较强，人为误差较大，而且矩类指标更需要人工通过公式计算得出，使研究人员的工作量加大。因此，研究人员渴望开发出一

5、种专14用的彗星图像分析软件。近年来，各国研究机构纷纷推出各自的图像分析软件，这些分析软件可以快速提供一系列评价参数，如彗星总长、尾长、尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩等，更好地客观定量DNA损伤。目前，用于彗星分析的软件包括英国KineticImaging公司的Komet5.5、PerceptiveInstruments公司的CometAssayⅢ、LAI公司的LACAAS、美国NIH的ImagJ、TriTek公司的CometScoreTM、印度原子能研究所的SCGE-Pro、奥地利癌症研究所开发的自动分析软件等。其中的部分软件可以到其相应网站下载，

6、但最好与相应的彗星分析系统硬件设备配套使用，价格昂贵，提高了研究成本。新近研发的彗星分析软件（CometAssaySoftwareProject,CASP）很好地解决了这一问题，该软件可以在普通微机上运行，界面友好，使用方便，分析速度快，可以一次同时给出最多达13个指标，分析结果避免了人为误差，更加客观和准确，结果可以以.txt文件直接输出，SPSS等统计软件可以直接读取其输出结果，便于统计学分析，节省大量人力物力。14中性电泳与碱性电泳在适合的实验条件范围内，没有损伤的细胞在中性或碱性条件都不可能做出尾巴。中性检测DNA双链断裂，碱性检测DNA单链断裂

7、。根据实验设计的需要，可以选择不同的实验条件，也可以同时选择两种条件，结果进行对比。拿电离辐射来说，中性和碱性检测的敏感范围不同，碱性SCGE的敏感范围值偏低，如可以小到0.05Gy，而中性SCGE的敏感范围值偏高，它可能检测不到0.05Gy的DNA损伤，但可以检测大到100Gy的损伤，而相对中性SCGE来说，碱性SCGE在大剂量照射时的各项指标容易形成平台。从修复方面来说，双链断裂的修复较单链断裂的修复慢，损伤重，后果更严重，双链断裂是后来形成染色体畸变和微核的主要物质基础。从文献上来看，药物引起的DNA损伤多采用碱性SCGE检测单链断裂，A：碱性电泳

8、是在1988年建立的，而最开始彗星方法都是在中性条件下做的（1984），所以我认