嘌呤霉素溶液配制及使用介绍.docx

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1、北京华越洋生物提供QQ:1733351176嘌呤霉素Puromycin编码品名规格单位北京华越洋生物GT001304-25mgGT001304-10ml嘌呤霉素（Puromycin）嘌呤霉素（Puromycin）25mg10ml瓶瓶嘌呤霉素Puromycin作用机制：嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomycesalboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，嘌呤霉素Puromycin通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。嘌呤霉素Puromycin某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。嘌呤霉素Pur

2、omycin作为氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。但是嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。嘌呤霉素Puromycin抗性基因：对嘌呤霉素的抗性取决于编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC)的Pac基因，遗传工程研究使用的Pac基因分离自嘌呤霉素产生菌Streptomycesalboniger。嘌呤霉素Puromycin最普遍应用：1）嘌呤霉素如今普遍应用于筛选和维持培养含Pac基因的哺乳动物稳定转染细胞。嘌呤霉素在细胞稳

3、转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。2）在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。化学特性：化学名称：3(a-Amino-p-methoxyhydrocinnamamido)-3–deoxy-N,N–dimethyladenosine·2HClCASNo.：58-58.2，分子式：C22H29N7O5.2HCl，分子量：544.43g/mol纯度：＞98%（HPLC）,易溶于水5-50mg/mL，-20度保存。嘌呤霉素Puromycin应用浓度：哺乳动物细胞

4、的推荐使用浓度为1-10μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定。LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。北京华越洋生物提供QQ:1733351176嘌呤霉素Puromycin使用步骤：（哺乳动物细胞筛选）►嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）嘌呤霉素Puromycin为了筛选到稳定表达待研究shRNA的细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。所以初次做实验的客户一定要建立适合自己体系的杀死

5、曲线（killcurve）。（1）24孔板内以5~8x104cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。►嘌呤霉素Puromycin筛选稳定转染细胞（1）day0：24孔板内以5~

6、8x104cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在

7、某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。北京华越洋生物提供QQ:1733351176嘌呤霉素Puromycin储存方法和稳定性：嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。为了达到

8、最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20°C，保质期为2年。嘌呤霉素Puromycin应用文献：1.为了说明Parp1基因和ADP核糖多聚体位