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《nyt 553-2002 禽支原体病诊断技术.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、ICS11.220B41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T553-2002禽支原体病诊断技术Diagnostictechniquesforavianmycoplasmosis(mycoplasmagallisepticum)2002一08一27发布2002门2一01实施中华人民共和国农业部发布NY/T553-2002目11舀禽支原体病(avianmycoplasmosis)又称鸡败血支原体(mycoplasmgallisepticum,简称MG),常引起鸡的慢性呼吸道疾病。MG也可感染火鸡,引起传染性窦炎。世界动物卫生组织仁worldOrganizationforAnimalHealt
2、h(英),OfficeInternationaldesEpizooties(法),OIE]将本病例B类动物疫病,我国将其列为二类疫病。本标准规定的方法与OIE《诊断试验与疫苗标准手册》推荐相应方法一致。本标准的附录A为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:农业部动物检疫所。本标准起草人:郭福生、尹燕博、蒋正军、孙淑芳、陆明哲、龚振华。NY/T553-2002禽支原体病诊断技术1范围本标准规定了禽支原体(MG)分离鉴定和快速血清凝集试验(RSA)的技术要求。本标准适用于鸡和火鸡及其产品MG的检测。2禽支原体的分离和鉴定21材料准备
3、2.1门培养基制备见附录A(规范性附录)。2.1.2兔抗MG阳性血清和抗免荧光抗体结合物。2.2分离2.2.1采样活禽从鼻腔、食管、气管、泄殖腔和交合器中取样。死禽从鼻腔、眶下窦、气管或气囊采样,也可吸取眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物。对于鸡胚从卵黄囊内表面、口咽和气囊采样。2.2.2样品的处理采样后应尽快培养。如须运输,小块组织置于支原体培养基中,拭子在培养基中用力搅拌数次,将培养基运回实验室尽快培养。2.2.3接种将样品0.2mI一接种于1.8mI支原体液体培养基中,依次10倍稀释至10-3,密封,3TC培养。同时将样品接种于支原体固体培养基中,置于含5%-10%二氧化碳(COQ)
4、培养箱中培养。2.2.3.1每天检查液体培养基酸碱度,一旦发现pH值变化,立即接种于固体培养基中培养。若培养基酸碱度没有变化,每隔3d-5d盲传一代,共传3代,培养10d后接种于固体培养基上培养2.2-3.2固体培养基上若有菌落生长,用低倍显微镜观察菌落,可见中央突起呈荷包蛋样(有时不典型),需进一步作血清学鉴定。2.3鉴定2.3.1用间接荧光抗体试验QFA)鉴定MG.取1.0cm-1.5cm的琼脂块,菌落面朝上置于载玻片上,第一块载玻片上放一块待检分离物、一块已知MG菌落(S‘或R株)、一块已知其他支原体菌落,第二块载玻片上放一块待检分离物。2.3.2第一块载玻片上每块琼脂块上加一滴适当
5、稀释的兔抗MG血清,第二块载玻片上琼脂块上加一滴正常兔血清。2.3.3琼脂块在湿盒中室温条件下反应30min后,分别放到含有磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.2)的不同器皿中,冲洗10min,共冲洗2次。2.3.4将琼脂块放回原玻片.吸水纸吸取过多的水分,每块琼脂加上稀释好的抗兔荧光抗体结合物,反应、洗涤同前,最后将琼脂块放回玻片,吸干多余水分后于人射式荧光显微镜下检查结果2.4结果判定菌落呈现亮绿色荧光时为阳性反应,若仅有暗淡的菌落轮廓,与背景荧光颜色差别不大为阴性。其他已知支原体菌落、第二块载玻片分离物为阴性;第一块载玻片分离物、与己知MG菌落为阳性结果时,证明分离物为鸡毒支原体。NY/
6、T553-20023快速血清凝集试验(RSA)3.1从鸡群采集的血清样品,如不能立即进行试验,应4℃保存,不能冻结。3.2试验用染色抗原、阳性及阴性对照血清。3.3操作方法:室温中加一滴(20VL)血清于白瓷板或玻板上,再加等量染色抗原,用棉签或火柴棒将其混合,轻轻摇动玻板使之混合均匀。试验设阳性血清及阴性血清对照。3.4结果判定:室温条件下,56'C30min处理后的鸡血清2min内,火鸡血清3min内判定结果。规定时间内,发生完全凝集的,判为阳性。如仅在液滴边缘部分出现凝集,或超过2min(火鸡3min)在边缘出现凝集,判为可疑。超过规定时间无凝集者,判为阴性。NY/T553-2002
7、附录A(规范性附录)支原体培养墓的制备A.1支原体肉汤培养基A.1.1新鲜酵母浸出液的制备:称取250g具有活性的鲜酵母,悬浮于1000mL蒸馏水中,加热至沸点,冷却。3000r/min离心20min,TIK出上清液,用0.1mol/L氢氧化钠(NaOH)调pH至7.8-8.0。过滤除菌,置4C保存备用。A.1.2甲液:不含结晶紫的支原体(PPLO)肉汤培养基(Difco)14.7g,加蒸馏水或去离子水700mL,A.1
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