NYT553-2002禽支原体病诊断技术.pdf

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1、ICS11.220B41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T553-2002禽支原体病诊断技术Diagnostictechniquesforavianmycoplasmosis(mycoplasmagallisepticum)2002一08一27发布2002门2一01实施中华人民共和国农业部发布NY/T553-2002目11舀禽支原体病(avianmycoplasmosis)又称鸡败血支原体(mycoplasmgallisepticum，简称MG)，常引起鸡的慢性呼吸道疾病。MG也可感染火鸡，引起传染性窦炎。世界动物卫生组织仁worldOrg

2、anizationforAnimalHealth(英),OfficeInternationaldesEpizooties(法),OIE]将本病例B类动物疫病，我国将其列为二类疫病。本标准规定的方法与OIE《诊断试验与疫苗标准手册》推荐相应方法一致。本标准的附录A为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:农业部动物检疫所。本标准起草人:郭福生、尹燕博、蒋正军、孙淑芳、陆明哲、龚振华。NY/T553-2002禽支原体病诊断技术1范围本标准规定了禽支原体(MG)分离鉴定和快速血清凝集试验(R

3、SA)的技术要求。本标准适用于鸡和火鸡及其产品MG的检测。2禽支原体的分离和鉴定21材料准备2.1门培养基制备见附录A(规范性附录)。2.1.2兔抗MG阳性血清和抗免荧光抗体结合物。2.2分离2.2.1采样活禽从鼻腔、食管、气管、泄殖腔和交合器中取样。死禽从鼻腔、眶下窦、气管或气囊采样，也可吸取眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物。对于鸡胚从卵黄囊内表面、口咽和气囊采样。2.2.2样品的处理采样后应尽快培养。如须运输，小块组织置于支原体培养基中，拭子在培养基中用力搅拌数次，将培养基运回实验室尽快培养。2.2.3接种将样品0.2mI一接种于1.8m

4、I支原体液体培养基中，依次10倍稀释至10-3，密封，3TC培养。同时将样品接种于支原体固体培养基中，置于含5%-10%二氧化碳(COQ)培养箱中培养。2.2.3.1每天检查液体培养基酸碱度，一旦发现pH值变化，立即接种于固体培养基中培养。若培养基酸碱度没有变化，每隔3d-5d盲传一代，共传3代，培养10d后接种于固体培养基上培养2.2-3.2固体培养基上若有菌落生长，用低倍显微镜观察菌落，可见中央突起呈荷包蛋样(有时不典型)，需进一步作血清学鉴定。2.3鉴定2.3.1用间接荧光抗体试验QFA)鉴定MG.取1.0cm-1.5cm的琼脂块，菌落面

5、朝上置于载玻片上，第一块载玻片上放一块待检分离物、一块已知MG菌落(S‘或R株)、一块已知其他支原体菌落，第二块载玻片上放一块待检分离物。2.3.2第一块载玻片上每块琼脂块上加一滴适当稀释的兔抗MG血清，第二块载玻片上琼脂块上加一滴正常兔血清。2.3.3琼脂块在湿盒中室温条件下反应30min后，分别放到含有磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.2)的不同器皿中，冲洗10min，共冲洗2次。2.3.4将琼脂块放回原玻片.吸水纸吸取过多的水分，每块琼脂加上稀释好的抗兔荧光抗体结合物，反应、洗涤同前，最后将琼脂块放回玻片，吸干多余水分后于人射式荧光显微镜下

6、检查结果2.4结果判定菌落呈现亮绿色荧光时为阳性反应，若仅有暗淡的菌落轮廓，与背景荧光颜色差别不大为阴性。其他已知支原体菌落、第二块载玻片分离物为阴性;第一块载玻片分离物、与己知MG菌落为阳性结果时，证明分离物为鸡毒支原体。NY/T553-20023快速血清凝集试验(RSA)3.1从鸡群采集的血清样品，如不能立即进行试验，应4℃保存，不能冻结。3.2试验用染色抗原、阳性及阴性对照血清。3.3操作方法:室温中加一滴(20VL)血清于白瓷板或玻板上，再加等量染色抗原，用棉签或火柴棒将其混合，轻轻摇动玻板使之混合均匀。试验设阳性血清及阴性血清对照。3

7、.4结果判定:室温条件下，56'C30min处理后的鸡血清2min内，火鸡血清3min内判定结果。规定时间内，发生完全凝集的，判为阳性。如仅在液滴边缘部分出现凝集，或超过2min(火鸡3min)在边缘出现凝集，判为可疑。超过规定时间无凝集者，判为阴性。NY/T553-2002附录A(规范性附录)支原体培养墓的制备A.1支原体肉汤培养基A.1.1新鲜酵母浸出液的制备:称取250g具有活性的鲜酵母，悬浮于1000mL蒸馏水中，加热至沸点，冷却。3000r/min离心20min,TIK出上清液，用0.1mol/L氢氧化钠(NaOH)调pH至7.8-8

8、.0。过滤除菌，置4C保存备用。A.1.2甲液:不含结晶紫的支原体(PPLO)肉汤培养基(Difco)14.7g，加蒸馏水或去离子水700mL,A.1