禽白血病诊断技术

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1、禽白血病诊断技术规程1　范围本规程规定了禽白血病（ALV）临床诊断、实验室诊断的技术要求。本规程适用于辽宁省境内禽白血病的诊断、疫情监测及流行病学调查。本规程中的临床诊断方法为筛选方法，筛选结果为疑似的病禽采集病料进行实验室检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法NY/T680—2003禽白血病病毒P27抗原酶联免疫吸附试验SN/T1172—2003禽白血病琼脂免疫扩散试验J-亚群禽白血病防治技术规范3　临床诊

2、断3.1　临床症状禽白血病病鸡无特异的临床症状，部分患有肿瘤的鸡表现消瘦，头部苍白，并由于肝部肿大而导致患鸡腹部增大。禽白血病感染率高的鸡群产蛋量很低。潜伏期较长，最早可见5周龄鸡发病，但主要发生于18周～25周龄的性成熟前后鸡群。总死亡率一般为2％～8％，但有时可超过10％。3.2　剖检病变特征性病变是肝脏、脾脏肿大，表面有弥漫性的灰白色增生性结节。在肾脏、卵巢和睾丸也可见广泛的肿瘤组织。有时在胸骨、肋骨表面出现肿瘤结节，也可见于盆骨、髋关节、膝关节周围以及头骨和椎骨表面。在骨膜下可见白色石灰样增生的肿瘤组织。4　实验室诊断4.1　病原分离鉴定4.1.1　鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备取10

3、d～12d龄SPF鸡胚按常规方法制备CEF，置于35㎜～60㎜平皿或小方瓶中。待细胞单层形成后，减少维持用培养液中的血清至1％左右。4.1.2　病料的处理和接种4.1.2.1　病料的处理1.1.1.1.1　血清或血浆样品：从疑似病鸡无菌采血分离血清或血浆。1.1.1.1.2　肝、脾、肾组织样品：取1g～2g组织研磨成匀浆后，按1：1加入无菌的PBS，置于1.5mL离心管中10000r/min离心20min，用无菌吸头取出上清液，移入另一无菌离心管中，再于10000r/min离心20min，按10000IU/mL量加入青霉素后备用。1.1.1.1.3　传代培养：用胰酶溶液将感染的CEF单层消化后

4、，再作为第2代细胞接种于另一块带有3～4片载玻片的35㎜～60㎜平皿中，继续培养7d。1.1.2　病毒的检测1.1.2.1　间接荧光试验（IFA）：将带有感染的CEF的载玻片取出，用丙酮－乙醇（7：3）混合液固定后，用ALV单克隆抗体或单因子血清及FITC标记的抗小鼠或抗鸡Ig标记抗体做间接荧光试验。在荧光显微镜下观察有关呈病毒特异性荧光的细胞。1.1.2.2　聚合酶链式反应（PCR）：从CEF悬液提取基因组DNA作为模板，以特异引物进行扩增，回收产物进行测序；或克隆后测序，将测序结果与已发表的ALV株比较，基因序列同源性应在85％以上。1.2　禽白血病病毒P27抗原酶联免疫吸附试验操作方法见

5、NY/T680—2003。1.3　禽白血病琼脂免疫扩散试验操作方法见SN/T1172—2003。1.4　反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）1.4.1　材料1.4.1.1　样品的采集与处理无菌采集病鸡的全血、病变组织，在无菌条件下将样品充分研磨，并加入0.04mol/L　PBS(pH7.4)制成1：5悬液，3000r/min离心10min，取上清备用。1.4.1.2　试剂—TaqDNA聚合酶；—AMV反转录酶；—dNTP；—DL2000DNAMarker；—琼脂糖；—核酸提取试剂Trizol；—氯仿；—异丙醇；—DEPC水；—ddH2O；—75%乙醇（DEPC水配制）。1.4.2　方法1.4

6、.2.1　样品总RNA的提取1.1.1.1.1　取上清液250μL加入用DEPC水处理过的1.5mL离心管中，加入750μLTrizol病毒裂解液，颠倒混匀。阳性对照、阴性对照与样品同时提取RNA。1.1.1.1.2　室温静置5min，加入250μL氯仿，混匀。1.1.1.1.3　静置2min，4℃12000r/min离心10min。1.1.1.1.4　小心吸取上清液加入另一干净的用DEPC水处理过的1.5mL离心管中，再加入等体积的异丙醇，混匀。1.1.1.1.5　静置5min，4℃12000r/min离心10min。1.1.1.1.6　小心倒掉上清液，加入1000μL75%的乙醇（用DEP

7、C水配制）；4℃13000r/min离心2min。1.1.1.1.7　小心倒掉上清液，置37℃温箱5min。1.1.1.1.8　加40μLDEPC水溶解，-70℃保存。1.1.1.2　反转录反应（RT反应）在0.2mlPCR管中配制如下体系：—下游引物1μL；—RNA模板1μL；—5×RTBuffer2μL；—dNTP（10mM）1μL；—RNA酶抑制剂0.5μL；—AMV反转录酶0.5μL；—D