液相色谱培训一：方法简介.ppt

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1、液相色谱培训一、方法简介1、历史2、特点3、原理4、分类1、历史1.1、色谱法：色谱法最早是由俄国植物学家茨维特在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。1.2、经典液相色谱法：液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法。1、历史1.3、高效液相色谱法：高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于20世纪60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。又称高压液相色谱法或高速液相色谱法

2、。今后的一系列培训，均是针对高效液相色谱法来说的，不再另作说明。2、特点2.1、高压：压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。2.2、高速：流速为0.1~10.0ml/min，通常为1.0ml/min。2.3、高效：在同一根色谱柱中，可同时分离成份可达百种。2、特点2.4、高灵敏度：常用紫外检测器灵敏度可达0.01ng（1g的一百亿分之一）。2.5、消耗样品少：每次进样0.01~0.1ml，常用0.01和0.02ml。2.6、速度快：通常分析一个样品在15~30min，有些样品甚至在5min内即可完成。2、特点2.7、分辨率高：可选

3、择适宜的固定相和流动相，以达到最佳分离效果。2.8、柱子利用率高：用一根色谱柱可分离不同的化合物，可反复使用。2.9、成功率高：系统条件确定后，均可获得满意的结果。3、原理溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引等）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。再深入一步来说，就是利用不同物质间性质的细微差别，使其在色谱柱上所显现的保留行为有所不同进行分离的。4、分类高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、离子交换色谱法、液液分配色谱法、离子

4、对色谱法等常见方法。4.1、液固吸附色谱法根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。常用的固定相（吸附剂）为硅胶或氧化铝，粒度5~10µm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物。4、分类4.2、离子交换色谱法根据流动相中被分离的离子组分与固定相离子具有不同的电荷吸引力而分离。固定相是离子交换树脂，常在聚合物骨架表面上接上羧基、磺酸基等阳离子或季氨基等阴离子。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。4、分类4.3、液液分配色谱法根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。将特定的物质化学键合于担体表面而形成的固定相，如C1

5、8柱、C8柱、氨基柱、氰基柱和苯基柱等。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。4、分类4.3.1、正相色谱法采用极性固定相(如氨基与腈基等)。流动相为疏水性溶剂(如正已烷、环已烷），常加入异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间，在过程中需要注意，从流动相配制到分析结束，不要引入水分。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、氨基酸类等）。4、分类4.3.2、反相色谱法采用非极性固定相（如C18、C8等）。流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、四氢呋喃等水溶性有机溶剂以调节保留时间。常用于分离非极性和极性较

6、弱的化合物。仅以水或缓冲液作为流动相都会伤害C18、C8等固定相，流动相中加入它们是为了溶解样品和保持样品在溶液中的稳定性。4、分类反相色谱法应用广泛：占整个HPLC应用的80%左右，是我们在日常分析工作中使用最多的方法。反相色谱法的局限性：固定相使用的pH值范围通常为2.5~7.5，因为太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。虽然近年出现了pH值范围为更宽的色谱柱，但其在超过pH值2.5~7.5范围使用时，寿命往往较短。4、分类4.4、离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非

7、极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。4、分类4.4、离子对色谱法分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵等。固定相常用ODS柱（即C18柱），流动相为甲醇（或乙腈）-水，水中加3~10mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。本次培训结束谢谢大家！