《液相色谱培训》PPT课件

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1、液相色谱基础知识一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素色谱组分液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析流动相只起运载样品分子的能力液相色谱基础知识HPLC的分离类型正相色谱(NP-HPLC)反相色谱(RP-HPLC)反相离子对色谱(RPIC)离子交换色谱(IEC)空间排阻色谱(SEC)手性化合物分离模式(Chiralseparationmode)液相色谱按两相极性不同分为:正相色谱反相色谱化合物保留

2、时间随流动相配比的变化不同极性的化合物出峰顺序正相HPLC色谱柱硅胶型氰基型氨基型糖类分析二醇基型蛋白质分析SilicagelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)ModifiedSi反相HPLC色谱柱C18(ODS)typeC8(octyl)typeC4(butyl)typePhenyltypeTMStypeCyanotype-Si-C18H37SiNon-polarproperty色谱柱:非极性溶剂:极性水/甲醇/乙腈反相色谱液相色谱流程图输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器溶剂数据处理流动

3、相流动相选择注意事项：纯度：采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相配制时的顺序溶剂等级水的等级纯化水蒸馏水去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率水/MeOH梯度ODS柱鬼峰GradientCurve1ml/min,0-100%MeOHover10minsandholdfor15mins.溶剂等级鬼峰的出现溶剂等级溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45um的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒)优级纯的纯度比分析纯大,但里

4、面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.22um的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱甲醇乙睛正己烷分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图溶剂等级溶剂前处理过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。过滤膜种类水系过滤膜有机系过滤膜30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50µl。13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格,材料为纤维素。3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.22µm和0.4

5、5µm两种规格。处理样品体积为7µl。样品过滤头的类型：滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。溶剂前处理脱气目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小气泡对测定的影响：1）柱压波动，流量偏小2）基线波动返回流路中形成气泡引起的问题改变保留时间和

6、峰面积流动相中形成气泡对液流的不良影响泵中形成气泡使液流波动峰变形柱中气泡形成和累积使流动相绕流尖峰或锯齿状噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声输液泵输液泵控制方式：恒流控制恒压控制输液泵类型：注射泵柱塞往复泵隔膜泵柱塞往复泵单向阀马达和凸轮柱塞杆柱塞杆密封圈泵头10-100uL柱塞往复泵优点压力脉动小易于更换溶剂缺点需要更换柱塞杆密封圈岛津VP系列输液泵目的单元流速范围特性和应用分析LC-10ADVP0.001-9.999无脉动，适于半微量LC和LC-MSLC-10ATVP0.001-9.999非凡的耐用性，适于常量分析*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度等度洗脱输液

7、泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂梯度洗脱A泵进样器色谱柱柱温箱检测器B泵AB时间B浓度分析时间长分离度差MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODStype)等度洗脱95%30%MeOH浓度梯度洗脱梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度注意事项：溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如