血红蛋白与核黄素的凝胶.pptx

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1、血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验目的掌握凝胶层析的原理掌握柱层析的基本装置熟悉凝胶层析的操作过程主要内容层析技术凝胶层析柱层析的基本装置用SephadexG-25凝胶层析柱将血红蛋白与核黄素的混合液分离什么是层析技术利用混和物中各组分理化性质（吸附力、分子形状、大小、分子极性、分子亲和力以及分配系数）的差异，在物质经过两相中进行分离的一种技术。本世纪初（1903年），俄国植物学家M.C.Jber发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素，还含有其他色素，实际上他使用的吸附层析。现在层系法

2、已成为生化、分子生物学及其它学科领域有效的分离、分析工具之一。层析技术的原理层析技术的分类1．按两相所处物理状态分类气相层析：气液层析（固定相为液体）和气固层析（固定相为固体），流动相为气体液相层析：液液层析（固定相为液体）和液固层析（固定相为固体），流动相为液体2．按层析方式分类柱层析：固定相装于柱内，使样品沿着一个方向移动而分离薄层层析：将适当粘度的固定相均匀铺在薄板上，点样后，用流动相展开纸层析：用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开血红蛋白与核黄素血红蛋白核黄素分子质量68000分子质量

3、376凝胶层析的原理凝胶渗透色谱就是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种色谱技术，当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛作用，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用，本实验血红蛋白分子量大，不易渗入网络，被排阻在凝胶颗粒之外，因而所受到阻滞作用小，先流出色谱床。核黄素分子量小，能渗透到网络的内部，洗脱流程长，因此所受到的阻滞作用大，后流出色谱床，这样就可以达到分级分离的目的。凝胶层析的介质柱层析的基本装置柱层析的预备实验器材与试剂仪器1．色谱柱：高40

4、cm，内径10mm2．恒流泵3．自动分部收集器4．刻度吸管、试管5．722型分光光度计试剂⑴葡聚糖凝胶SephadexG-25或SephadexG-50。⑵0.2％维生素B2饱和水溶液：称取维生素B20.2g，溶于少量蒸馏水，转入100mL容量瓶,加蒸馏水至刻度。⑶生理盐水。⑷血红蛋白溶液：取草酸钾抗凝血2mL置离心管中，3000r/min离心5min，使血细胞沉淀，弃去血浆及白细胞层。向红细胞沉淀加入生理盐水4mL，振摇洗涤，3000r/min离心5min，弃去上清液。向沉淀加入蒸馏水2mL，

5、混匀，猛烈振摇促使红细胞溶血释放血红蛋白。即为上清血红蛋白溶液备用。⑸0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2)：取0.1mol/L磷酸氢二钠720mL和0.1mol/L磷酸二氢钠280mL，混匀。实验操作1.凝胶准1备 称取SephadexG-255g或SephadexG-503g，加磷酸盐缓冲液50mL，置于水中浸泡6小时（沸水浴中溶胀2小时)，用磷酸盐缓冲液漂洗，去除漂浮的细小颗粒。2.装柱 取直径0.8~1.2cm长25~30cm的层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层玻

6、璃棉或海绵垫。关住层析柱出口，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。当凝胶颗粒沉积约2cm高时，打开出口，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高度达18cm时为止。关闭层析柱出口，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹，表面要平整。如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉，即可使表面平整。凝胶床表面要保留1cm高的缓冲液。3.样品制备 将维生素B2饱和水溶液和血红蛋白溶液按1:1(体

7、积比)混匀。4.加样 打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。用吸管吸取待分离样品溶液约0.5mL，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床。然后再用滴管沿层析柱内壁加入磷酸盐缓冲液，约1cm高。加样不可过多，以免分离不完全。5.洗脱 将装有细玻璃管的橡胶塞塞住层析柱入口，使细玻璃管的下端插入液面，但不可卫生资格考试网接触凝胶床表面。将装有磷酸盐缓冲液的下口瓶调好位置，使其略高于层析柱，将其流出管接在层析柱橡胶塞的细玻璃管上，保持密

8、闭状态。打开下口瓶出口，然后打开层析柱出口，使磷酸盐缓冲液缓缓流出，保持4~6滴/min的流速。洗脱速度不可过快，以免区带不清晰。6.收集 随着层析的进行，凝胶床将出现两条明显的区带，血红蛋白区带在下，维生素B2区带在上。当血红蛋白区带即将流出时，开始收集，每管收集约1mL，直到流出液变为无色为止，约需收集5~6管；以同样方法收集维生素B2。7.测定 在540nm波长下，以磷酸盐缓冲液调零，测定血红蛋白和维生素B2各管吸光度。8.结果及分析 以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。分析实验