最新实验　血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离PPT课件.ppt

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1、实验血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离什么是层析？层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），于1903-1906年由俄国植物学家M.Tswett首先系统提出来。他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图（Chromatography）。为何需要固定相和流动相？任何层析都有两相：固定相(stationaryphase)与流动相(mobilephase)，两相互不相溶。固定相：是层析的基质。可以是固体物质（如吸附剂，

2、凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。对层析的效果起着关键的作用。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。凝胶层析根据什么来分离混合物？混合物中各种成分因分子大小不同而被分离的技术分子筛效应大分子物质因其分子直径大于凝胶网孔而不能进入凝胶颗粒内部，流程短而移动速度快，先流出层析柱；小分子组份则由其分子直径小于网状结构的孔径而进入凝胶颗粒内部，流程长而移

3、动速度慢，后流出层析柱，Polymerbeadscomposedofcross-linkeddextran(dextrose)whichishighlyporous(likeSwisscheese)凝胶层析的原理b.蛋白质混合物上柱c.样品上柱后，小分子进入凝胶微孔，大分子不能进入，故洗脱时大分子先洗脱下来d.小分子后洗脱下来凝胶层析介质交联葡聚糖，商品名为Sephadex，它是由葡聚糖交联而成的多孔性网状结构的凝胶颗粒交联琼脂糖凝胶，如Sepharose-6B。聚丙烯酰胺基葡聚糖凝胶，商品名Sephacryl。葡聚糖(dextran)3-氯-1,

4、2-环氧丙烷(Epichlorohydrin)交联葡聚糖是葡聚糖与3－氯－1,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。Sephadex可以分成不同的型号,有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。交联度可用“吸水量”表示，如每克凝胶吸水量为2.5克即定为G-25型。吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大，排阻极限越大，分离范围也越大。凝胶层析的特点及其应用特点操作条件温和，不会引起生物大分子的变性失活一次装柱后凝胶可反复使用，每次洗脱过程即是凝胶的再生过程具有高

5、度的重复性，回收样本几乎可达100%，既可用于大样本制备，亦可用于小样品的分析应用脱盐；高分子溶液的浓缩；蛋白质分子量的测定；生物大分子的分离提纯缺点样品浓度会发生数倍稀释；上样量较小，仅占柱床体积2-5%。柱层析的主要操作步骤介质的选择与处理装柱柱子装的质量好坏，是能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。平衡柱子装好后，要用所需的缓冲液平衡柱子。平衡液体积一般为3-5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。柱层析的主要操作步骤（续）加样加样量的多少直接影响分离的效果。一般说来，加样量尽

6、量少些，分离效果比较好。通常加样量体积应低于5%的床体积。洗脱洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。流速太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。流速太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。收集、鉴定及保存一般采用部分收集器收集分离纯化的样品。每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml/管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5ml/管。再生许多基质可反复使用多次，且价格昂贵，所以层析后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。洗脱液储液瓶（高位槽）层析柱记录仪紫外检测仪部分收集器实验目的1、掌握凝胶层析原理2、熟悉

7、凝胶层析柱的装柱、检查、上样、洗脱与收集过程试剂1、葡聚糖凝胶：SephadexG-252、血红蛋白及核黄素3、洗脱液：0.05MpH7.3磷酸缓冲液注：Sephadex由于含有羟基基团，呈弱酸性，使它有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。4、层析系统：层析柱（1×30cm），恒压高位槽，自动部分收集器5、分光光度计血红蛋白（Hemoglobin)MW:68,000核黄素（RiboflavinorVitaminB2)MW:376实验操作1、凝胶处理：溶胀与浮选2、装柱3

8、、平衡：控制流速为1ml/分4、加样与洗脱：加样0.5ml用少量洗脱液清洗管内壁1-2次然后将洗脱液在柱内约加至2cm高，