凝胶层析分离丙种球蛋白与核黄素

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1、SephadexG葡聚糖凝胶特点：1、经典的葡聚糖和环氧丙烷偶联介质，拥有极高的流速2、多种不同的分离范围，提供了广泛的选择性。葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。四、凝胶层析分离丙种球蛋白与核黄素1．原理凝胶过滤是广泛应用于蛋白质、酶、核酸等生物高分子分离分析的有效方法之一，它是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析方法。此类层析的固相载体是具有分子筛性质的凝胶，目前使用较多的是具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶(商品名为

2、Sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Biogel)以及琼脂糖凝胶(商品名为Sepharose)，此外还有这些凝胶的各类衍生物。本实验以葡聚糖凝胶为例，学习凝胶过滤的一般原理及方法。葡聚糖凝胶是由一定分子量的葡聚糖(右旋糖苷)和甘油基以醚桥(一p～CH2CH—CH2一p一)loH形式相互交联形成三维网状结构的一种水不溶性物质。通过控制交联剂环氧氯丙烷和葡聚糖的配比以及交联时的反应条件可控制交联度而获得具有不同“网眼”的凝胶。“网眼”的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围，可分离的分子量从几百到数十万不等。由于凝胶骨架中的多糖链含有大量OH基，因此凝胶具有极强的亲水性，

3、能在水和电解质溶液中膨胀，凝胶的交联度越大，孔径和吸水量越小，因而膨胀度也愈小。不同型号的交联葡聚糖用G表示(如G一25，G一100等)，G后面的数字为凝胶的吸水量(mL水／g于胶)乘以10得到的数，如G一25即表示此型号凝胶吸水量是2．5mL／g干胶。根据交联度的高低，Sephadex分为G10—200，号越高，凝胶孔径越大。其物理特性如下表：交联葡聚糖凝胶的物理特性┏━━━━━━┳━━━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━┓┃商品名称┃分离范围┃水容值┃柱床体积┃水化所需时间(小时)┃┃┃┃┃┣━━━━┳━━━━━┫┃Sephadex┃(分子量)┃(m

4、L／g干胶)┃(mL／g干胶)┃22℃┃100℃┃┣━━━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━┫┃G～10┃700┃1．0±0．1┃2～3┃3┃1┃┃G～15┃1，500┃1．5±0．2┃2．5～3．5┃3┃1┃┃G～25┃1，OOO～5，000┃2．5±0．2┃4～6┃3┃1┃┃G～50┃1，500～30，000┃5．0±0．3┃9～11┃3┃1┃┃G～75┃3，000～70，000┃7．5±0．5┃12～15┃24┃3┃┃G～100┃4，000～150，000┃10±1．0┃15～20┃72┃5┃┃G～150┃5，000～400，000┃

5、15±1．5┃20～30┃72┃5┃┃G，～200┃5，000～800，000┃20士2．0┃30，～40┃72┃5┃┗━━━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━┛进行工作时一般根据欲分离物质的大小及工作目的来选择合适的葡聚糖凝胶装层析柱。待分离的物质通过此柱时，各组分相互之间由于分子量大小各不相同以及在固定相上的阻滞作用的差异而在柱中以不同的速率移动。分子量大于允许进入凝胶“网眼”范围的物质完全被凝胶排阻，不能进人凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，移动速度快而先流出层析柱；分子量小的物质可完全渗入凝胶颗粒，阻

6、滞作用大，流程长，移动速度慢，从层析柱中流出就较晚。若物质分子量介于完全排阻和完全渗入的凝胶物质的分子量之间，则在二者之间从柱中流出。由此就可达到分离的目的。对于混合物中某一被分离成分在凝胶层析柱内的洗脱行为，常用分配系数K。来度量。T，V。一Von8一—可■式中V。——外水体积，即凝胶柱中凝胶颗粒之间所含水和缓冲液体积。Vi——内水体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。V。——洗脱体积，即被分离成分通过凝胶柱所需洗脱液的体积。当一种被分离成分的分子全部排阻时，其洗脱体积就是V。。I：全排阻成分的洗脱峰。·_v。一v。，．．．Kd--—V弋e--．产V—o一0Ⅱ：能进入部分凝胶孔隙的成分的洗

7、脱峰。’．‘V。