间充质干细胞的基础和临床应用研究进展.doc

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1、间充质I:细胞的基础和临床应用研究进展【关键词】间充质干细胞；细胞治疗；临床研究组织工程学是刚刚发展起來的新兴应用学科，是利用体外培养的方法将某些具有干细胞特性的细胞诱导分化为目的纽织或器官以供临床所需。组织工程学的关键在于得到能分化为所需组织的干细胞，其次是使干细胞分化为特定组织的条件。最近许多研究农明，人类、啮齿类、鸟类等动物的骨髓中可分离出一种细胞,它具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、肌管、内皮及神经分化的潜能，这就是间充质二］•细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)⑴。干细胞独特的生物学特征和诱人的应用前景，与纽织工程相结合

2、成为21琵纪生命科学研究领域的热点之一。尤其是成年干细胞跨系统、跨胚层分化潜能的发现，不仅对细胞生物学理论的发展有重大意义，而口对心血管、肿瘤、免疫、遗传等方面疾病的治疗以及器官重建和损伤修复具有深远的影响。最新研究发现，成体干细胞町以横向分化(transdifferentiation)为其他细胞和组织类型，为英广泛应用提供了理论依据和实验基础(2,3)。目前在成体干细胞研究领域中，MSCs备受注目。1MSCs的分离培养及鉴定1.1分离方法用于分离MSCs的方法有4种：密度梯度离心法、贴樂筛选法、流式细胞分选法和磁珠分离法。H前MSCs的分离培养主耍采

3、用密度梯度离心法和贴壁筛选法结合，达到分离纯化的目的。密度梯度离心常用的分离剂有Percoll和Ficoll,两者理化特性不同，分离效果也不同。但经过分离剂分离后，所获得的贴舉细胞同源性好。限定性传代培养及冻存复苏后，细胞生物学特性及分化潜能保持不变。日前国内外大多数实验室均采用此种方法。1.2培养二维培养技术己普遍应用，尽管逐步得到改善，但仍存在着难以克服的缺点：①贴壁表面积有限，细胞产量低；②无菌操作过程繁琐，容易污染；③代谢产物逐渐积累，排除不及时易引起细胞生长不良其至退化;④细胞离开了体内同细胞外基质共同构成的三维立体结构，生物学行为受到影响，

4、容易变异。除此之外，利用干细胞进行诱导分化研究，二维培养休系不能满足需耍，因此有人提出三维培养的设想。Glowacki用胶原海绵作为载休进行三维灌注培养，减少了代谢产物的聚集，结果发现细胞外基质含量增高，所培养的细胞活性和功能均增强(4L但cytodex3和胶原海绵均为实心载体，农面积较小，细胞难以大规模扩增，而大载体生物反应器U成功用于某些植物和动物细胞的大规模离体培养，能否将其应用于MSCs的扩增培养，并形成产业化，从而满足细胞工程和基因工程对种子细胞量的需求，还有待于一•些问题的顺利解决，如大孔微载体的研制、细胞与载体的黏附、贴壁细胞的洗脱等。1

5、.3鉴定山于目前尚缺乏MSCs的特异性标志，对MSCs的特征描述及其分离方法都是以细胞群体的形式进行。许多研究表明，MSCs能表达多种衣面抗原，但只具有相对特异性，因此人们一直致力于特异性抗体的研究。1991年Simmons等利用STRO1抗体富集MSCs⑸；1992年Haynesworth用人骨髓基质细胞免疫小鼠，筛选出3个杂交瘤即SH2、SH3、SH4,其产生的抗体识别人MSCs,而不与骨髄造血细胞系、骨髄基质成纤维细胞反应，也不与成骨细胞和骨细胞反应，因此认为SH2、SH3、SH4这三种抗体是日前鉴定人MSCs的特并性抗体⑹。茂I」1999年，B

6、arry与Haynesworth首次利用SH2单克隆抗体，从人MSCs中分离纯化该抗原，通过多肽序列分析和质谱测量法确定为CD105,并作为MSCs的细胞表面标志⑺。随后SH3、SH4两种抗体所识别的不同抗原决定簇也确定为CD73⑻。另有研究报道，MSCs可特异表达SB10,它与激活的白细胞黏附分子柑同，并且在分化过程中消失(9)o最近，Quirici等发现并利用低亲和力神经生长因子受体抗体，从骨髓中分离出同源性较高的MSCs,并证明具有多分化潜能，U获得成功(10)o随着对MSCs农面抗原的研究，人们会找到越来越多的抗体对其分离鉴定。山于MSCs没有

7、特并性衣面标志物，所以冃前釆用联合鉴定方法：细胞化学、免疫纽化及流式细胞分析方法。MSCs具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性棊酚酸酯酚及糖原（PAS）阳性，酸性磷酸酶（ACP）及苏丹黑（SB）阴性，根据这些特点，町达到初步鉴定的目的。进一步鉴定通过免疫纽化方法，MSCs表达CD29、CD44、CD7I、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166等表面抗原（11）。不表达分化相关标志如II、III型胶原、骨桥蛋白等,也不表达造血系统标志，包括CD14、CD34及白细胞共同抗原CD45。最后用流式细胞分析方法，鉴定MSCs这种细胞群的同源

8、性或者纯度，Haynesworth的研究小纽进行流式细胞分析显示，原代培养细胞同源性可达到95