分子检测技术-论述.doc

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1、分子检测技术论述题1.导致出现假阴性最常见的原因包括哪些？为了防止假阴性的出现，应该注意哪几个方面的问题？答：出现假阴性结果般常见的原因包括：©TaqDNA聚合酚活力不够，或活性受到抑制；②引物设计不合理：③提取的模版质最不够或数最不过关以及PCR系统欠妥当：④循环次数不够。为了防止假阴性的出现，应该注意以下几个方血的问题：①在选用TaqDNA聚合解时，要注意用活力高，质昴好的悔；②再提取PCR模版时，应特别注意防止能抑制TaqDNA聚合晦活性的物质（如酚，氯仿）污染DNA模版提取物；③尽管TaqDNA聚合稱对模版

2、纯度要求不高，但是DNA模版提取物屮不允许有破坏性的有机试剂存在；④在PCR扩増的先决条件及特异性是引物与靶DNA良好的互补，尤其是要绝对保证引物的3'端与靶基因的互补：⑤山于M/+浓度对TaqDNA聚合酶的活性影响很大，所以要注意采用适当的浓度的Mg2+,另外，PCR反应的各温度点的设置也应合理。2.DNA提取方法步骤以及RAPD方法。答：DNA的提取方法步骤:（DCTAB法是一种快速简单的提取植总DNA的方法：先将新鲜的叶片在液氮屮研坯，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出來，再经氯仿一异戊醉

3、抽提除去蛋白质,垠后得到DNAo（2）SDS法是植物总DNA的提取方法。先将新鲜叶片在液氮屮研憐以机械力破碎细胞樂，然后加入SDS使细胞膜破裂，并同时将蛋门质和多糖等杂质与核酸分开，加入Kac可使SDS—蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更完全。RAPD技术建立于PCR技术基础上，它是利用一系列（通常数百个）不同的随机排列碱基顺序的寡聚核昔酸单链（通常为10聚体）为引物，对所硏究基因组DNA进行PCR扩增，聚丙烯醜胺或琼脂糖电泳分离，经EB染色或放射性自显影來检测扩增产物DNA片段的多态性。3・禽流感检

4、测技术进展。答：随着血清学实验技术和分子生物学技术的飞速发展，目前在检验检疫，疾病控制，农业及畜牧业领域，禽流感诊断技术的研究也不断取得新的进展。1•早期血清学诊断技术：⑴琼脂扩散（AGP）试验进行病毒抗原型特异性鉴定：适用于鉴定流感病毒，此法虽然简单易行，但是緻感性较差，易出现假阴性。⑵血凝试验（HA）和血礙抑制试验（HI）：HA和HI是病毒学常用的检测指标。HA和HI特异性好，是亚型鉴定的常用方法，但其操作过程繁琐费时，并且山于用己知HA亚型的抗血清不能检测出新的HA亚型禽流感病毒，所以用该方法鉴定不如用琼脂扩

5、散试验简便和快捷。（3）神经氨酸酶促试验：山于神经氨酸酶的活性位点在禽流感病毒中十分保守，因此ZstatFlu检测的结果十分可靠，不会山于病毒的变异造成漏检。检测特异件高达99%。⑷中和试验（NT）：NT试验是最徴感而特异的血清学方法。但病每屮和试验操作繁顶耗时费料，临床上几乎不用,但作为经典方法在病海鉴定中起着車要作用,许多新的检测方法都要以此作为标准进行比较。⑸酶联免疫吸附法（ELISA）：AGP和HI的放感性均不如ELISAo⑹免疫荧光技术（IFT）：即荧光抗体技术（FAT）,IFT用于诊断具有快速，简便，敏

6、感性好的特点，而且费用较低。2•新兴分子生物学诊断技术：常规血清学诊断技术山于历史悠久，对技术要求相对较低，仍是H前世界上采用比较广的方法。但它们不能为疾病作出早期，明确的诊断，有的在准确度，标准化等方面还有较大的缺陷。而新兴的分子生物学诊断技术在这方面有了明显的突破。⑴荧光定量PCR（RT-PCR）：具有高度的做感性和特异性，并且可大大缩短对AI病毒的检出时间，克服了传统的禽流感诊断技术包括病毒分离鉴定试验周期长的缺点，为禽流感早期快速诊断提供了斂感，快速，实用的检测方法。⑵依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）：

7、该法检测禽流感病毒的放感性与经典的鸡胚病原分离方法相当，并具有检测速度快，特异性强，易于操作的特点，为主管部门确定疫情和采取防范措施争取了宝贵的时间。4.目前我们所学检验检测技术有哪些实际应用？答：1•在病毒检测方面的应用：用PCR和Dig-cDNA探针检测番茄环斑病锋（95年；用实时荧光RT-PCR和杂交诱捕RT-PCR-ELTSA对李坏死环斑病毒进行检测（03用；2.在细菌检测方面的应用:89年建立了梨火疫病菌DNA杂交技术，03年建立梨火疫细菌实时荧光和诱捕PCR-ELISA的方法；03年应用实时荧光PCR建

8、立了水稻口叶枯病菌与水稻条斑病菌两变种间区别鉴别体系：3.在真菌检测方面的应用:98年在对Vcrticilliumdahliac核糖体基因ITS区段测序的基础上设计并合成了一对特异性引物，其扩増的分子片段可作为鉴定探测大丽轮枝菌的分子标记；4.在其他方面的应用：在线虫鉴定方面:02年廖晓兰等在国际上首次设讣并合成植原体广谱荧•光探针和椰子致死黄化，苹果从生利