DB22T 2560-2016 水貂病毒性肠炎检疫技术规范.pdf

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1、ICS11.220B41备案号：54237-2017DB22吉本标准仅供内部使用不得翻印林省地方标准DB22/T2560—2016水貂病毒性肠炎检疫技术规范Quarantineprotocolforminkviralenteritis本标准仅供内部使用不得翻印2016-12-09发布2017-03-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2560—2016本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口于吉林省畜牧业管

2、理局。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：王伟利、王建科、孟庆峰、程悦宁、易立、姚贵哲、王准、宋翱、程世鹏。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2560—2016本标准仅供内部使用不得翻印水貂病毒性肠炎检疫技术规范1范围本标准规定了水貂病毒性肠炎的病原分离鉴定、HA-HI试验、PCR、Real-timePCR及动物回归试验等诊断技术要求。本标准适用于水貂病毒性肠炎的检疫、疫情监测和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的

3、引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析试验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件本标准仅供内部使用不得翻印MEV：水貂肠炎病毒F81：猫肾传代细胞CPE：细胞病变Real-timePCR：实时荧光定量PCRPBS：磷酸盐缓冲液HA：血凝试验HI：血凝抑制试验4材料与试剂4.1材料——注射器（5mL、20mL）——吸管（5mL、10mL）——离心管（1.5mL、0.2mL）——吸头——96孔微量血凝板——细胞培养瓶——PCR管——试验动物：3月龄健康水貂（水貂肠炎病毒HI抗体效

4、价≤1∶4）4.2试剂——DEPC双蒸水（双蒸馏水1000mL、DEPC1mL，室温放置28h以上，0.105MPa蒸汽高压30min。1DB22/T2560—20164℃或室温保存）——培养液（DMEM粉10g、碳酸氢钠3.7g，溶于1000mL双蒸水中，抽滤分装，4℃保存）——营养液（DMEM培养液900mL、犊牛血清100mL，加青霉素、链霉素，使其浓度分别达到200IU/mL、本标准仅供内部使用不得翻印200µg/mL抽滤除菌）——维持液（DMEM培养液980mL、犊牛血清20mL，加青霉素、链霉素使其终浓度分别达200IU/mL、200µg/mL，抽滤除菌）——胰蛋

5、白酶溶液（胰酶2.50g、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）0.20g、无钙镁PBS1000mL，抽滤除菌，4℃保存备用）——新生犊牛血清——青霉素——链霉素——阿氏液（葡萄糖2.05g、拘椽酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.82g、双蒸馏水二级水中溶解后，用盐酸将pH值调至6.1，高压蒸汽灭菌20min，最后用二级水定容至100mL，4℃保存备用。）——蛋白酶K（三羟甲基氨基甲烷（Tris）（pH7.8）1.20mg（0.01mmol/L）、乙二胺四乙酸（EDTA）1.86mg（0.005mmol/L）、SDS5.00g、三蒸水1000mL、加入蛋自酶K，使成为20mg

6、/mL，即为贮存液；使用浓度为50µg/mL）——RNaseA（20µg/mL，10mmol/LTris-HCl（pH8.0）1.21g、15mmol/LNaCl0.89g、RNaseA0.02g，加去离子水使其终浓度为20µg/mL。分装，－20℃保存备用）——Tris饱和酚本标准仅供内部使用不得翻印——酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）——无水乙醇——70%乙醇——TE（pH8.0）（10mmol/LTris-Cl（pH8.0）1.21g、lmmol/LEDTA（pH8.0）0.37g、去离子水800mL，调节pH至8.0，用去离子水定容至1000mL）——TaqDNA聚

7、合酶（5U/μL）——dNTPs（每种浓度均为10mmol/L）——RNasin（40U/μL）——MgCl2（15mmol/L）——琼脂糖（电泳级）——DNAMarkerDL2000——50×Tris-冰乙酸（TAE）电泳缓冲液（Tris282.0g、冰乙酸57.10g、0.5mol/LEDTA（pH8.0）100mL，三蒸水定容至1000mL，0.105MPa蒸汽高压30min，备用）——溴化乙锭溶液（10mg/mL）（三蒸水100mL、溴化乙锭1g，置棕色瓶中，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后