DB22T 2560-2016 水貂病毒性肠炎检疫技术规范

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1、ICS11.220B41备案号：54237-2017DB22吉林省地方标准DB22/T2560—2016水貂病毒性肠炎检疫技术规范Quarantineprotocolforminkviralenteritis2016-12-09发布2017-03-01实施吉林省质量技术监督局发布DB22/T2560—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口于吉林省畜牧业管理局。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：王伟利、王建科、孟庆峰、程悦宁、

2、易立、姚贵哲、王准、宋翱、程世鹏。IDB22/T2560—2016水貂病毒性肠炎检疫技术规范1范围本标准规定了水貂病毒性肠炎的病原分离鉴定、HA-HI试验、PCR、Real-timePCR及动物回归试验等诊断技术要求。本标准适用于水貂病毒性肠炎的检疫、疫情监测和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析试验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件MEV：水貂肠炎病毒F81：猫肾传代细胞CPE：细胞病变Real

3、-timePCR：实时荧光定量PCRPBS：磷酸盐缓冲液HA：血凝试验HI：血凝抑制试验4材料与试剂4.1材料——注射器（5mL、20mL）——吸管（5mL、10mL）——离心管（1.5mL、0.2mL）——吸头——96孔微量血凝板——细胞培养瓶——PCR管——试验动物：3月龄健康水貂（水貂肠炎病毒HI抗体效价≤1∶4）4.2试剂——DEPC双蒸水（双蒸馏水1000mL、DEPC1mL，室温放置28h以上，0.105MPa蒸汽高压30min。1DB22/T2560—20164℃或室温保存）——培养液（DMEM粉10g、碳酸氢钠3.7g，溶于1000mL双蒸水中，抽滤分装，4℃保存）

4、——营养液（DMEM培养液900mL、犊牛血清100mL，加青霉素、链霉素，使其浓度分别达到200IU/mL、200µg/mL抽滤除菌）——维持液（DMEM培养液980mL、犊牛血清20mL，加青霉素、链霉素使其终浓度分别达200IU/mL、200µg/mL，抽滤除菌）——胰蛋白酶溶液（胰酶2.50g、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）0.20g、无钙镁PBS1000mL，抽滤除菌，4℃保存备用）——新生犊牛血清——青霉素——链霉素——阿氏液（葡萄糖2.05g、拘椽酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.82g、双蒸馏水二级水中溶解后，用盐酸将pH值调至6.1，高压蒸汽灭菌20min

5、，最后用二级水定容至100mL，4℃保存备用。）——蛋白酶K（三羟甲基氨基甲烷（Tris）（pH7.8）1.20mg（0.01mmol/L）、乙二胺四乙酸（EDTA）1.86mg（0.005mmol/L）、SDS5.00g、三蒸水1000mL、加入蛋自酶K，使成为20mg/mL，即为贮存液；使用浓度为50µg/mL）——RNaseA（20µg/mL，10mmol/LTris-HCl（pH8.0）1.21g、15mmol/LNaCl0.89g、RNaseA0.02g，加去离子水使其终浓度为20µg/mL。分装，－20℃保存备用）——Tris饱和酚——酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）

6、——无水乙醇——70%乙醇——TE（pH8.0）（10mmol/LTris-Cl（pH8.0）1.21g、lmmol/LEDTA（pH8.0）0.37g、去离子水800mL，调节pH至8.0，用去离子水定容至1000mL）——TaqDNA聚合酶（5U/μL）——dNTPs（每种浓度均为10mmol/L）——RNasin（40U/μL）——MgCl2（15mmol/L）——琼脂糖（电泳级）——DNAMarkerDL2000——50×Tris-冰乙酸（TAE）电泳缓冲液（Tris282.0g、冰乙酸57.10g、0.5mol/LEDTA（pH8.0）100mL，三蒸水定容至1000mL

7、，0.105MPa蒸汽高压30min，备用）——溴化乙锭溶液（10mg/mL）（三蒸水100mL、溴化乙锭1g，置棕色瓶中，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器保存于室温）——1%琼脂糖凝胶（琼脂糖1g、TAE电泳缓冲液（50倍）2mL、灭菌三蒸水98mL、微波炉中完全融化，加溴化乙锭溶液）——SYBR®Premix，商品化的荧光定量PCR试剂盒可以用来进行荧光定量PCR反应体系的配制——F81传代细胞——猪的红细胞：1%猪红细胞悬液（用20mL注射器先