SNT1142-2011马病毒性动脉炎检疫技术规范.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１４２—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１１４２—２００２，ＳＮ／Ｔ１３７７—２００４马病毒性动脉炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犲狇狌犻狀犲狏犻狉犪犾犪狉狋犲狉犻狋犻狊２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１３７７—２００４《从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验操作规程》和ＳＮ／Ｔ１１４２—２００２《马病毒性动脉炎微量血清中和

2、试验操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１１４２—２００２和ＳＮ／Ｔ１３７７—２００４相比，主要的技术变化如下：———增加了血液、组织中的病毒分离；———增加了酶联免疫吸附试验方法；———增加了荧光ＲＴＰＣＲ试验方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：梁成珠、朱来华、郑小龙、李西峰。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１４２—２００２；———ＳＮ／Ｔ１３７７—２００４。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１马病毒性动脉炎检疫技术规范

3、１范围本标准规定了马病毒性动脉炎的病毒分离鉴定、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验和荧光ＲＴＰＣＲ试验等方法。本标准适用于进出境马属动物病毒性动脉炎的诊断和检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９—２００８实验室生物安全通用要求３缩略语下列缩略语适用于本文件。ＲＫ１３：兔肾细胞ＰＢＳ：磷酸盐缓冲生理盐水ＣＰＥ：细胞病变反应ＥＡＶ：马病毒性动脉炎病毒ＴＣＩＤ５０：半数组织感染量ＥＬＩＳＡ：酶

4、联免疫吸附试验ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ：荧光反转录聚合酶链式反应４临床诊断４．１临床特征发病马的临床症状表现不一，一般为发热，精神沉郁，食欲不振，流鼻液，流泪，结膜炎，眼睑水肿，颔下淋巴结肿大，白细胞减少，四肢特别是后肢下端水肿，雄马阴囊及包皮肿胀，妊娠马流产。老龄雌马和营养状况差的马临床症状较重，妊娠马比空怀雌马症状明显。如果妊娠马群发生ＥＡＶ流行，流产率可高达４０％～５９％。４．２判定根据４．１临床检查可作出初步判定，确诊需进行实验室检测。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１１４２—２０１１５病毒分离鉴定５．１仪器设备超净工作台

5、或生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮贮存罐、蔡氏滤器和微孔滤膜（０．２２）、高压灭菌锅、离心机、超声波破碎仪、微量细胞培养板（９６孔）、微型振荡器、微量可调移液器μｍ（２００）、电子天平、细胞瓶和吸管（１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ）等。μＬ５．２试剂与材料ＭＥＭ培养基、抗生素贮存液、细胞消化液、细胞培养液和细胞维持液、１％细胞染色液、７．５％羧甲基纤维素、红细胞裂解液、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）、兔肾细胞（ＲＫ１３）、马病毒性动脉炎病毒（ＥＡＶ）标准病毒株（Ｂｕｃｙｒｕｓ株）和各种常规试剂等，试剂配制见附录Ａ。５．３样品采集与处理５．３．１样品采集与运送无菌采集动物抗凝全血

6、（不宜用肝素作抗凝剂），死胎或活产马驹的脑、心、肺、肝、肾、脾和淋巴结等组织，公马可采集精液。采集的样品应立即放入冰盒中，尽快运送到实验室。如果不能及时送往实验室，组织样品冷冻于－２０℃以下保存（抗凝全血样品４℃保存）。５．３．２样品处理５．３．２．１全血样品的处理：取抗凝血加入２倍～３倍体积红细胞裂解液，混匀静止４ｍｉｎ～５ｍｉｎ，待红细胞完全破碎，１５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液除去破碎的红细胞，得到白细胞沉淀（若仍有红细胞，则重复上述步骤，直到红细胞除尽）。加入ＰＢＳ缓冲液，制成白细胞悬液，反复冻融两次，低温（－２０℃）保存备用。５．３．２．２动物组织样品的处理：无菌处理

7、样品，样品称量，置于无菌容器内，加入少量维持液，用灭菌研槌研磨，制备成组织悬液。再加培养液，制成终浓度为１０％的组织悬液。以２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收取上清液低温（－２０℃）保存备用。５．３．２．３动物精液的处理：将精液超声波裂解三次（３００ｗ），每次１５ｓ；然后在４℃下２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，沉淀精子细胞，取上清液低温（－２０℃）保存备用。５．４病毒分离５．４．１将上述上清液或细胞悬液用维持液作倍比稀释，无菌接种于已长成单