DB22T 2600-2016 梅花鹿、马鹿茸片鉴别方法PCR法.pdf

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1、ICS67.120B45备案号：54271-2017DB22吉本标准仅供内部使用不得翻印林省地方标准DB22/T2600—2016梅花鹿、马鹿茸片鉴别方法PCR法IdentificationofSikaDeerandWapitiVelvetSlices——PolymeraseChainReaction本标准仅供内部使用不得翻印Method2016-12-22发布2017-04-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2600—2016本标准仅供内部使用不得翻

2、印前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：杨颖、邢秀梅、荣敏、刘敏、武薇、吴琼、徐超、徐佳萍、涂剑锋、刘汇涛、刘华淼。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2600—2016本标准仅供内部使用不得翻印梅花鹿、马鹿茸片鉴定方法PCR法1范围本标准规定了梅花鹿、马鹿茸片的PCR鉴定方法的原理、试剂或材料、仪器设备、试验步

3、骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施。本标准适用于梅花鹿、马鹿茸片产品的真伪鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义本标准仅供内部使用不得翻印下列术语和定义适用于本文件3.1鹿茸片deervelvetslices为梅花鹿和马鹿的商品茸利用特制的切具切制的薄片。4原

4、理利用梅花鹿、马鹿线粒体DNA（mtDNA）的D-loop区特异性基因序列设计引物，应用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增特异性DNA片段，依据是否扩增出特异性片段对鹿茸片进行鉴定。5试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.1水，GB/T6882，一级。5.2十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。5.3三羟甲基氨基甲烷（Tris）。5.4乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。5.5十二烷基硫酸钠（SDS）。5.6氯化钠。5.7三氯甲烷。5.8异丙醇。5.9无水乙醇。1DB22/T2600—20165.1070%乙醇。5.

5、11CTAB提取缓冲液：20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNa2EDTA,pH8.0。5.12CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl。本标准仅供内部使用不得翻印5.13蛋白酶K溶液（20mg/mL）。5.14NaCl溶液（1.2mol/L）。5.15TE缓冲液（Tris-Cl、EDTA缓冲液）：10mmol/LTris-HCl（pH8.0）,1mmol/LEDTA（pH8.0）。5.16引物，，DF5-CAAAGCACGTGATA

6、TAACCTTATG-3，，DR5-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-36仪器设备6.1PCR仪。6.2紫外分光光度计或核酸蛋白分析仪。6.3电泳仪。6.4凝胶成像系统。6.5电子天平：感量0.0001g。6.6离心机：离心力≥12000rpm。6.7涡旋振荡器。6.8恒温水浴锅。本标准仅供内部使用不得翻印6.9研钵或粉碎装置。6.10微量移液器：0.5μl～10μl，10μl～100μl，20μl～200μl，200μl～1000μl。7试验步骤7.1样品制备将样品用研钵或粉碎装置研磨成粉末状即

7、可。7.2DNA提取7.2.1将样品研磨后，称取200mg左右样品于2mL离心管中，加入1.5mLCTAB提取缓冲液和40μL蛋白酶K溶液。7.2.260℃震荡过夜后13000g离心10min，转移上清液到新的离心管中。7.2.3加入750μL三氯甲烷后用力震荡，13000g离心5min，将上清液转移到新的离心管中。7.2.4加入2倍体积的CTAB沉淀溶液，室温静置60min，13000g离心15min，弃去上清液。7.2.5加入350μLNaCL溶液将沉淀进行悬浮。再加入350μL三氯甲烷，涡旋振荡进行混匀，1

8、3000g离心10min。7.2.6转移上清液后加入0.6倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清液。7.2.7加入500μL75%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于200μL超纯水中。立即使用或-20℃保存备用。7.2.8也可用等效的DNA提取方法提取模板DNA。7.3DNA质量的测定2DB22/T2600—2016使用紫外分光光度计或