专题1-1.2基本操作程序.ppt

《专题1-1.2基本操作程序.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序的步骤：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞一、目的基因的获取1、目的基因概念：主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2、目的基因获取方法：从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因化学方法直接人工合成(1)从基因文库中获取目的基因基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）基因文库的构建过程基因组文库限制酶供体细胞的全部D

2、NA大量DNA片段拼接到载体上导入受体细胞扩增单链RNA逆转录酶杂交双链核酸酶HDNA聚合酶单链DNA双链DNARNA链DNA链部分基因文库的构建过程cDNA文库mRNA杂交双链单链DNA反转录双链DNA部分基因文库的构建过程mRNA杂交双链单链DNA反转录cDNA文库双链DNA基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较如何从基因文库中找到所需要的基因？依据目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性。从基因文库中获取目的基因为什么要构建基因文库呢？①所需目的

3、基因的序列完全不知；②只知道目的基因序列的一段；③想从一种生物体内获取许多基因；⑤想知道这种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有何不同；④想知道这种生物与另一种生物有多少基因不同；⑥想得到一种生物的全部基因组序列。(2)利用PCR技术扩增目的基因1.PCR的全称：多聚酶链式反应是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。2.结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增3.PCR的原理：DNA复制4.PCR技术扩增目的基因的前提条件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。PCR的过程：变性(90-95℃)退火(55-60℃)延伸(70

4、-75℃)方式：以指数形式扩增，即（2n）（n为扩增循环的次数）(2)利用PCR技术扩增目的基因过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链模板原料引物酶控制温度——目的基因DNA——四种脱氧核苷酸——如单链DNA分子片段——耐热的DNA聚合酶——PCR仪自动调控PCR的条件：

5、(2)利用PCR技术扩增目的基因(3)用化学方法直接人工合成条件：基因较小，核苷酸序列已知。主要是合成真核细胞的基因二、基因表达载体的构建—核心1、基因表达载体的构建目的：a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。b.使目的基因能够表达和发挥作用。二、基因表达载体的构建—核心2、基因表达载体的组成目的基因启动子终止子标记基因等启动子的作用：二、基因表达载体的构建—核心终止子作用：使转录在所需要的地方停止。标记基因作用：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来.是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了

6、它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。3．方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。目的基因与运载体结合（以质粒为运载体）三、将目的基因导入受体细胞动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。常用的受体细胞：将目的基因导入受体细胞的原理：方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞三、将目的基因导入受体细胞转化:目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（1）农杆菌转

7、化法①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。1.目的基因导入植物细胞③过程：③花粉管通道法（我国独创）②基因枪法（微弹轰击法）２.目的基因导入动物细胞常用的方法:显微注射技术操作程序：三、目的基因导入受体细胞a.先提纯含目的基因的表达载体b.从动物体内取出卵(受精卵）c.显微注射仪进行显微注射d.将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体3.目的基因导入微生物细胞原核生物的特点:繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少

8、。大肠杆菌的转化过程:用Ca2+处理细胞增加细胞壁的透性，与细胞膜无关三、目的基因导入受体细胞→感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子个体生物学水平鉴定—①检