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1、代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用Diagram一、L-苯丙氨酸的简介二、L-苯丙氨酸的生产方法三、L-苯丙氨酸的体内代谢途径四、L-苯丙氨酸的代谢调控五、展望代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用一、L-苯丙氨酸的简介L-苯丙氨酸是芳香族氨基酸，是人体八大必需氨基酸之一。常温下是白色结晶或结晶性粉末固体，有L-型、D-型两种消旋体和DL-型外消旋体，具有生物活性的是L-型光学异构体，即L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine，L-Phe)。代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用代谢
2、工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用二、L-苯丙氨酸的生产方法化学合成法：收率低，副产物多酶法：工艺路线短，生产能力强；酶的稳定性差，成本高微生物发酵法：成本较低、产物纯度高，对环境的污染相对较小3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸预苯酸苯丙酮酸分支酸分支酸变位酶（限速反应）预苯酸脱水酶（限速反应）DAHP合成酶（限速反应）三、L-苯丙氨酸的体内代谢途径E.coli是最常应用的菌种。图为以葡萄糖作为E.coli生长的碳源时的由DAHP生产L-Phe的详细路径图1、增强中心代谢途径代谢流：（1）加强基因aroF的超量表达：D
3、AHP的合成酶DS控制的反应是该途径中的第一个限速反应。DS是基因aroF、aroG、aroH控制的同工酶。代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用四、L-苯丙氨酸代谢调控（2）增加PEP的合成磷酸烯醇丙酮酸合成酶(PpsA)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PckA)是糖代谢中心途径中生成磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的2个关键酶,在大肠杆菌中分别由ppsA和pckA基因编码.扩增ppsA,pckA基因，使这两个基因单独表达或串联表达，都能提高PEP的合成量，进而提高DAHP的合成量。代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用（3）改造PTS系
4、统野生型大肠杆菌体内PEP的消耗主要是磷酰基转移系统(PTS系统)，丙酮酸激酶(pykA／pykF编码)，PEP羧化酶(ppc基因编码)。此通过改造PTS系统减少PEP的消耗可提高L-Phe产量。代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用2、分支途径代谢调控：代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用在pheA、tyrB基因克隆、串联克隆和表达完成的基础上,将aroG基因和pheA、tyrB基因以aroG-pheA-tyrB的顺序三基因串联到表达载体进行表达,提高酶活，提高L-Phe的产量。代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用基因克
5、隆及基因克隆流程图：代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用表：携带不同表达质粒的大肠杆菌的粗抽提物的酶比活增减倍数苯丙氨酸生物合成途径关键基因的串联表达：代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用优化关键酶基因pheA、aroF、ppsA、tktA的协同表达pheA:编码分支酸变位酶和预苯酸合成酶。简写成AaroF:编码DHAP合成酶。简写成FppsA：编码PEP合成酶。简写成PtktA：编码转酮酶。简写成T.代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用pZE21：含有卡那霉素抗性基因的质粒；pZE12：含有氨苄林抗性基因的质粒；pZA
6、31：含有氯霉素抗性基因的质粒CA-AFPT为pZA31-RBS-ppsA-tktA_pZE12-AF的简写CK-AFPT为pZA31-RBS-ppsA-tktA_pZE21-AF的简写。3、解除反馈抑制aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(AroG)是苯丙氨酸合成途径中的关键酶之一,受到苯丙氨酸的反馈抑制.通过使用苯丙氨酸类似物对氟苯丙氨酸(pFP)的筛选,获得初步解除对苯丙氨酸的反馈抑制突变株。通过DNAshuffiing技术有效的对ar0G基因进行改组,积累并引入有益突变,实现分子的定向进化
7、,解除AroG的苯丙氨酸反馈抑制。代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶是Phe合成途径中的关键酶之一,受到苯丙氨酸的反馈抑制.为得到解除苯丙氨酸反馈抑制的突变AroG,分别以Escherichiacoli(E.coli)野生型和突变型aroG基因和Salmonellatyphimnrium(S.typhimnrium)野生型aroG基因为亲本,通过DNAsuffling技术对aroG进行改组,获得的改组分子与载体pET30a连
8、接得到改组文库,转化到E.coliBL21(DE3)中,在含有Phe类似物对氟苯丙氨酸(p-FP)的培养基上筛选转化子,获得4个解除Phe反馈抑制的克隆..五、展望代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用1、苯丙氨酸生物工程菌构建的成功是令人鼓舞的。代谢工程在物种改良方面已经展现出了非常强的生命力.代谢工程在苯丙氨酸菌种
