BrdU-免疫荧光、免疫组化-增值检测方法.docx

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1、BrdU免疫荧光取第三代细胞接种于六孔板中，在接种的基础培养基中加入BrdU(终浓度为20μmol/ml),3d后将细胞爬片行BrdU免疫荧光染色，倒置荧光显微镜观察。免疫荧光检测步骤如下：1）固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min，4%多聚甲醛固定30min；2）变性：将固定好的细胞爬片PBS洗3次，每次5min（摇床转速60）；2mol/L的HCl室温下变性60min；3）中和：0.1mol/L的硼酸钠（PH8.5）中和10min,PBS冲洗10min,3次；4)孵一抗：用1%BSA溶液稀释抗BrdU抗体至终浓度为6μg/ml，在细胞爬片上滴加150-300μL，37℃湿盒中孵育6

2、0min；将孵好一抗的细胞爬片PBS洗10min，3次；5)孵二抗：用1%BSA溶液按1:600稀释FITC结合的goatanti-rabbit二抗，37℃湿盒中孵育60min，将孵好二抗的细胞爬片PBS洗3次，每次10min，注意避光；6)染核：每张爬片200μl浓度1ug/ml的DAPI溶液浸染3min，PBS洗2次，每次5min；7)封片：中性树胶封片，荧光显微镜观察。BrdU免疫组化（1）将制作的5μm厚的石蜡切片于60℃烘箱中烤片24h。（2）二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）各10min。（3）梯度乙醇水化各5min，100%、95%、85%、75%乙醇。（4）（4）流水冲洗5min。（5）（

3、5）3%H2O2室温避光孵育20min，阻断内源性过氧化物酶的活性。（6）（6）PBS浸泡5min，3次，在低速摇床上振摇水洗。（7）（7）加入0.1%胰酶抗原修复20min。（8）（8）PBS水洗2-3次，各5min。（9）（9）山羊血清室温下封闭20min。（10）（10）封闭后倒去血清，勿洗，滴加按说明书稀释的一抗，4℃过夜或者37℃两小时。（11）（11）PBS冲洗，5min×3次。（12）（12）滴加1：100稀释的二抗，37℃孵育30-60min，PBS冲洗，5min×3次。（13）（13）DAB显色，在显微镜下掌握染色的程度（一般约3-8s，无需看到组织变黄，组织变黄一般大

4、部分已假阳性），流水冲洗5min。（14）（14）苏木精复染2min，1%盐酸酒精分化10-20s。（15）（15）脱水、透明，中性树胶封片。（16）（16）显微镜下观察，采集图片。检验细胞增殖的检验方法：BrdU标记法1、细胞以1.5×105/ml细胞数接种于直径35ml培养皿中（内放置一盖玻片），培养1天，用含0.4％FCS培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于G0期。2、终止细胞培养前，加入BrdU（终浓度为30μg/L），37℃，孵育40min。3、弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。4、甲醇/醋酸固定10min。5、经固定的玻片空气干燥，0.3％H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化

5、酶。6、5％正常兔血清封闭。7、甲酰胺100℃，5min变性核酸。8、冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1：50），阴性对照加PBS或血清。（1）9、按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI）。