石蜡切片病理免疫组化及免疫荧光方案

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1、石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案石蜡标本固定、脱水、包埋方法人鼠自心脏灌注4%多聚甲醛内固定l-2h后取材：取脑出血血肿处脑组织（厚度约3mm）,置于塑料盒屮并浸泡在4%多聚甲醛小固定，室温川固定时间12-48h,固定好的组织脱水前应流水冲洗30min-lh左右除去固定液，取固定好的脑组织标本脱水、包埋。具体步骤按以下方法进行：此方法参考《组织病理学技术》周庚寅北京大学岀版社2006年70%：lh-2h80%：lh-2h90%：lh-2h95%：lh-2h95%：lh-2h无水I:30min-

2、60min无水II:30min-60min二甲苯及水水酒精1：1混合液二甲苯I:30min二甲苯II：30min石蜡I:lh石蜡II:lh石蜡III:lh30min包埋：在病理科包埋方法基础上灵活改进：在包埋铁模具上进行，融蜡-放置组织于中央-扣包埋盒4°C冷却lOmin-撬蜡。注意事项：1、固定液的种类：10%屮性甲醛，4%的多聚甲醛最合适，在37°或室温屮固定12-48h能很好保存抗原和抗体的反应能力，实验室用的更多的是在4°C冰箱中固定24h-3do冇人建议中性甲醛40摄氏度固定2~3小吋，

3、流水冲洗20min-30min,这样可以缩煎制片的时间。2、熔満温度65°C左右；3、严格按照预定实验步骤进行，保证脱水及透明完全，透明后见云雾状说明脱水不完全，需退回无水酒粕中返工。4、经一级二甲苯透明后检查组织是否透明，二级二「卩苯透明时间以具体时间而定。5、注意及时更换梯度酒精及二甲苯（1月）。组织石蜡切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》P12化学工业出版社20061.载玻片的处理：采用现成的APES处理过的硅化载玻片。2.石蜡切片注意事项：1、用于免疫组化的蜡温应为56-58°C,切片水

4、温为40°C左右，应先置于冷水中（冷水中可参入酒精有利快速展片-见相关方法），然后再移入热水屮，这样可以使切片顺利展平；2、烤片吋要注意:-般在62°C烤片30-60min,抗原较强的组织可在60摄氏度烤3〜8h,抗原较弱的组织可于37°C的恒温箱内过夜；3、切片如需长期保存，可置于4°C或室温下，千万不可脱蜡后4°C保存，因脱蜡后失去了对抗原决定族的保护。冰冻切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》P12化学工业出版社2006冰冻切片的优点是能较完整的保持抗原性。组织细胞的某些抗原成分，特别是细胞

5、膜抗原、受体抗原、酶及肽类抗原在石蜡切片处理过程中，可不同程度遭受破坏或失去抗原性，而冰冻切片能最大限度地保护抗原。缺点是冷冻过程屮形态结构町能破坏，抗原易弥散。方法:1.载玻片的处理：经明胶处理的载玻片。2.将新鲜组织置于-25C左右的恒冷箱中，待组织完全冷冻后即可连续切片。3.动物组织经4%多聚甲醛灌注内固定及其在4°C固定12-48h后，经40%蔗糖脱水沉底，吸干组织表面的液体后置于-25€左右的恒冷箱中，待组织完全冷冻后即可连续切片。4.取出切片后，应用电风吹冷风吹I：或白然「•燥。5.其

6、注意事项：1、温度不能太低，否则纟fl织表面易出现冰渣；2、抗卷板的位置要适屮，否则难以成片；3、贴片时动作轻而迅速，否则易出现褶皱4、组织从液氮或-80°C取ill，必须进行温度平衡后才能切成片，切完的组织如下次还用，应用冷冻头在没有完全溶解前取下，密封后低温保存。石蜡切片免疫组化：石蜡切片机切片，厚3〜5um,充分晾干（＞3小时）。烤箱62〜64度1小时后并能较好粘片，可长期保存。1.烤箱65度5分钟。2石蜡切片脱蜡至蒸锚水。（脱賭方法见后）30分钟3PBS冲洗，2分钟x2次。4抗原修复:微波

7、炉30分钟（大火15min,中火15分钟）浸泡在PH6.0的柠檬酸缓冲液里。自然冷却到室温PBS冲洗，2分钟x2次53%H2O2室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，2分钟x2次。65-10%正帘山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵冇20分钟，倾去血清，勿洗。7滴加稀释一抗工作液，37°C孵育小时或4°C过夜。（用100微升抗体稀释液稀释1微升一抗）8PBS冲洗，2分钟x3次。9滴加适量生物素标记二抗工作液，37°C或室温孵冇30分钟。10PBS冲洗，2分钟x3次。11滴加适量

8、的辣根酚或碱性磷酸酶标记的链需卵白素（SABC）工作液，37°C或室温孵育20分钟。12PBS冲洗，2分钟x3次。13显色剂显色5-15分钟（DAB）1ml蒸饰水+A,B,C各一滴。在显微镜卜观察效果。14蒸锚水2minX2次，15SE轻度复染＜lmin；必要时盐酸酒精分化数秒，见标本变粉红即可，分化后水洗5min.。16脱水；晾T,透明；17树胶封片。（注意：盖玻片要先自己洗好晾干，高质量盖玻片可不用清洗，PBS冲洗时间因方式而异,浸泡时，时I'可可缩短。严格配制PH值要求的缓冲