海绵来源真菌代谢产物中抗肿瘤活性成分研究.pdf

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1、第40卷第5期2010年5月中国海洋大学学报PERIODICAL0F0CEANUNIVERSITY0FCHINA40(5)：069～071May，2010海绵来源真菌代谢产物中抗肿瘤活性成分研究。陈立1’2，顾谦群2”(1．福州大学生物和医药技术研究院，福建福州350002；2．中国海洋大学医药学院，海洋药物教育部重点实验室，山东青岛266003)摘要：1株来源于海绵的真菌(Aspergillusrepens)其发酵产物的乙酸乙酯提取物表现出明显的细胞毒活性。本文采用溶剂萃取、硅胶柱层析及制备HPLC等分离手段，对该菌株发酵产物的活性部位进行了追踪分离，共分离得到3个

2、生物碱成分。通过理化性质及利用波谱学手段，鉴定其结构分别为meleagrin(1)、neoechinulinA(2)和preechinulin(3)。采用SRB法初步评价了化合物l～3的抗肿瘤活性，结果表明，化合物1对P388和K562细胞表现出明显的细胞增殖抑制活性。关键词：海绵来源真菌；次级代谢产物；结构鉴定；抗肿瘤中图法分类号：R282．77文献标志码：A文章编号：1672—5174(2010)05—069-03海洋微生物以其结构多样性和生物多样性越来越引起人们的兴趣，已成为近年来天然产物研究的热点领域。其中海洋微生物中较高等的真菌代谢途径复杂，次级代谢产物种类

3、繁多，活性多样，研究前景广阔。作者在海洋微生物抗肿瘤活性菌株的筛选过程中，得到l株具有明显抗肿瘤活性的真菌，经鉴定为匍匐曲霉菌(Aspergillusrepens)。为了阐明其活性成分，本文采用人慢性髓原白血病细胞株K562为筛选模型，以活性追踪的方法，从抗肿瘤活性组分中分离鉴定出3个化合物，分别为me-leagrin(1)、neoechinulinA(2)和preechinulin(3)，并对其细胞增殖抑制活性进行了初步评价。本文就化合物1～3的提取分离、结构鉴定及其抗肿瘤活性进行了报道。1材料与方法1．1仪器与试剂质谱用Q-TOFULTIMAGLOBALGAA07

4、6LC型质谱仪，核磁共振谱用日本JEOLJNM-ECP600型核磁共振仪测定。分析用高效液相色谱仪：Waters公司产品(Waters600，Waters996二极管阵列检测器，Millennium32工作站)，CapcellPakC-18柱(4．6mm×250mm，5gin)。制备用高效液相色谱仪：日本岛津公司产品，LC一6AD，SPD—M20AVP检测器，SCL一10AV型系统控制器，CapcellParkC-18柱(10mmX250ITlm，5tim)。柱色谱及薄层色谱用硅胶H(10"--40gin)(青岛海洋化工集团公司)。Sephadex"mLH-20(Ph

5、armacia公司)。活性测试采用P388和K562细胞。胎牛血清(FBS)和RPMI-1640细胞培养基分别为Hyclone公司(Cat．No．STF721)和Gibcobrl公司产品。丽丝胺罗丹明B(SRB)为Sigma公司产品。1．2菌株的分离与培养1．2．1菌种该菌株分离自广西北海采集的海绵样品，鉴定为匍匐曲霉菌(Aspergillusrepens)。1．2．2培养从固体培养基上取适量菌体，接种于装有3mL种子培养基(葡萄糖1．o％，甘露醇2．o％，酵母膏0．3％，麦芽糖2．ooA，蛋白胨0．5％，味精0．5％，陈海水配制，pH值调至6．0)的试管中，于25℃

6、静置培养3d得到种子培养液。将该种子培养液按1％的接种量接种于200瓶(每瓶含300mL液体培养基：可溶性淀粉10g／L，蛋白胨1g／L，海水素20g／L)的1000mL三角瓶中，25℃静置培养30d。1．3发酵液粗提物的制备将菌株的发酵培养物(60L)抽滤，发酵液用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，得到粗浸膏(8g)。1．4活性成分的追踪分离将菌株发酵培养物的粗浸膏(8g)进行减压硅胶柱色谱分离，以石油醚一丙酮系统梯度洗脱，得到7个组分(Fr．1—7)，其中Fr．3-5对K562细胞表现出明显的细胞毒活性。该活性组分经加压硅胶柱色谱(氯仿一甲醇系统)、凝胶柱色

7、谱(SephadexLH一20，甲醇)、凝胶柱色谱(SephadexLH一20，甲醇：丙酮1：1)以及半制备反相高效液相色谱(70％甲醇／水)分离，得到化合物1(40rag)；活性组分Fr．3经加压硅胶柱色谱(氯仿一甲醇系统)得到活性组分Fr．3-5，再经凝胶柱色谱(SephadexLH一20，氯仿：甲醇1：1)，凝胶柱色谱·基金项目：国家自然科学基金(30672527)；山东省自然科学基金重点项目(z2006C13)资助收稿日期：2009—12—25；修订日期：2010-03—17作者简介：陈立(1981一)，男，博士，助理研究员。E-mail：c