课程设计思路.ppt

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1、课程设计思路植物细胞工程动物细胞工程1.植物细胞的培养与再生2.烟草原生质体分离和体细胞杂交3.外源基因导入植物细胞及其筛选单克隆抗体的制备细胞工程蛋白质工程1.碱性磷酸酶的定点突变2.碱性磷酸酶突变体的酶活力和构象的比较研究开放设计实验突变:易错PCRpETBlue-2纯化：Ni2+螯合层析荧光光谱仪双光束紫外分光光度计α-淀粉酶的固定化及活性测定酶工程实验安排教学周实验内容13PCR基因扩增及扩增产物的回收，单抗--ELISA14质粒DNA的提取，DNA重组（限制性酶切和连接）单抗-细胞融合15DNA重组（连接产物转化表达菌株、筛选

2、）α-淀粉酶的固定化，单抗16表达，固定化酶的活性测定，单抗17表达产物的活性分析，单抗，总结碱性磷酸酶的定点突变反应体系ddH2OXuL2.5mmol/LdNTP4uL10xbufferMg2+Free5uL引物（10umol/L）2uL/each模板DNA1uLEx－TaqE0.3uL（1.5U）Mg2+（mM）2，3，4，5，6，7Mn2+（mM）0，0.05，0.10，0.15，0.20（94℃,1’—55℃,1’—72℃,2’）30个循环,72℃,10’0.8%琼脂糖凝胶1xTAEPCR产物的回收(博大PCR产物快速胶回收试剂

3、盒）1.切胶、称胶重,每100mg胶加入700uL溶胶液，550C溶胶(一定要完全溶解)。2.装柱，12000rpm离心30秒，去除废液。3.漂洗:500uL漂洗液，12000rpm,30秒漂洗一次，去除废液,重复漂洗一次。4.12000rpm,2分钟，换成干净的无菌1.5mL小管。5.向柱子的正中央加20uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。6.12000rpm,30秒。7.向柱子的正中央加10uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。8.12000rpm,2分钟。9.SYBR检测回收产物质粒DNA的提取接含pETBlue-2(质

4、粒的单菌落于4mLLB羧苄（50ug/mL）和四环素（12.5ug/mL）液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜4000rpm、离心1min，收集所有菌体150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min加入200uL溶液II（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清加入200uL溶液III（轻轻混匀!），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心10min上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀）12000rpm，离心5min上清加等体积的氯仿：异戊醇（旋涡混匀）12000rpm，离心5min上清

5、加2倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温30min12000rpm，离心10min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）12000rpm，离心5min沉淀于超净台中风干沉淀加入20uLRTE，600C水浴30分钟溶解-200C保存370C酶解3小时酶切产物的纯化和回收(博大PCR产物快速胶回收试剂盒）每100uL溶液加入700uL溶胶液，其余的操作步骤同前。向柱子的正中央加20uL洗脱buffer，其余的操作步骤同前。酶切反应体系（20uL）管号核酸10xbufferKddH2OBamHIHandIIItube1目的

6、基因AKP24uL3uL0uL2uL1uLtube2pETBlue-210uL2uL5uL2uL1uL酶切和连接连接反应体系（20uL）目的基因AKP载体pETBlue-210xLigasebufferddH2OT4DNA连接酶XuLYuL2uLZuL2uL控制载体和目的基因的比例为1：3－10140C连接过夜－200C保存，用于转化受体细胞感受态细胞的制备1.预培养：接DE3PlacI单菌落到含34ug/mLCam的3mLLB培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜2.取0.4mL预培养菌液转移到含34ug/mLCam的40mLL

7、B液体培养基的锥形瓶中，370C、250rpm振荡培养2.5-3小时（OD6000.4-0.5）3.将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min4.40C，4000rpm，离心10min5.到出培养液，将管倒置使培养液流尽6.菌体加入预冷的0.1mol/L的CaCl210mL，用5mL枪头轻轻吹散菌体细胞，冰浴30min7.40C，4000rpm，离心5min，去上清8.用冰预冷的0.1mol/L的CaCl22mL用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作9.分装细胞200uL/份，此为感受态细胞（也可于-700C或-200C冻存）取200uL感受

8、态细胞，加入连接产物10uL取200uL感受态细胞，加入质粒DNA2uL（5－50ng)（阳性对照）取200uL感受态细胞，加入2uL无菌水（阴性对照）取200uL0.1mol/L的CaCl2，加入连接产物