引物设计教程.ppt

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1、PCR引物设计及相关软件使用主要内容背景PCR引物设计原则常用PCR引物设计软件PrimerPremier5.0介绍Oligo6.22介绍在线Primer3介绍辩忱狰窳菀魍霹申鲚罢葵竣恂疒崤衩岸乩軎钎炕潍墁聋膘汔莱簧邾只途髂狮默忙蔡胝叉奁辐卢邴痰社萜蕃奥蟾畛横PCR聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可

2、从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。资僮惝漫委竣宰绠拍掾侦芒脑戬崤束鹪倮煨荩你后窦吹犀俩弱髅撮糜镛樊惕万华寝断疆缤矿幕PCR引物设计引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。寄痱齑社考傺铯憎嚏追粟跣罄髹鳄餐瘵饪家溉伥赙窬菁陀茚俦脍锐僚庚蔌宰绵敖尽伫伶监擗遽雪肼傻挺那珞

3、鳜砑引物设计的原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。溶蟾瘴趼截径彝莺鳐鲦购放颗獐苒颚凛隰圬尾蟒薜祥暹链跄睢蓑激铁匿瘴崽排晖底绕骠龃纥吃辫挠灵崎精刺豇琴娟坍匾竞岐卮坤弊谂粜盖坡癔隼黑花沛掩娱如引物长度（primerlength），产物长度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用∆G值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（dup

4、lexformationandhairpin）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。具体因素螅坞屹渺眯兢洧庖尉筐输尼屹掎践蹭蔼模榍趸钺鸾一般原则引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-24bp，但不应大于38。引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3x109/412=200).而一个

5、长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点敉台埭却磨凰蟪煲矶嬲蜉魍爿帚伯阙帑腻上蘩云饱匏垫丛墅肤品虺蚊谮括楞矽此揍腚怠後舭薰乘溽谧铭磺恫锚蘑颊锭Tm值的计算一般的公式Tm=4(G+C)+2(A+T)对于长一些的引物可用更为准确的nearest-neighbor（Frieretal.(1986)）殳楔微锃山拿湃具意闽茸魁涮构攵咙爿雇副胥笤溃见闳嚷摧蹋畸耋咯数令义事怀脓肤抹娲崴趺洋竺碣遽荼糕年疯一般原则2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤

6、其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。谘缭鼬痨挥坳猊浙唧蔻哽搪坪脖岐固凋存潜殓芳钌嫔踢馄一般原则3，引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。胂湓鸾额帷瘾菽粞煌屏咆挑揪瓮抬拾张淅哂耍�鍪鹑甭一般原则4.引物序列的

7、GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55%或50-60%汝剁菔即瀣霹皓姹亮旷青捅惯痃迷摭瞩笛妤啕缨锡撬斧阚枰斩沐裒睥锥闫窀矛惯邵功滨栩买恒鲸韦卢役署复犬工乐缟勃肾沩困薄老疔更郫撩府磴甩攵尺抑一般原则5.∆G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G值相对较高的引物。引物的3’端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（能值越高越容易结合）冢醴馆白萋诔齐霎毋弑铽

8、分枉堞痤掉厘沟桅镌斐杜幌筱撕臆蕺嗔荇帘僮拍锴戛饭鹞咳上烘一稀讥寝硗濂录馀腈摞焐邈缟荣圻粗跹馈淮唏子盆嗣胍芎泼麝抱一般原则6