PCR技术在乙肝方面的应用.ppt

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1、PCR技术在乙肝方面的应用TheapplicationofPCRtechniqueinHBV涿州市医院检验科刘鹏年HepatitisBVirus乙型肝炎的病原体在全世界广泛流行，估计全球半数以上人口已被HBV感染过。中国：乙肝高发区，人群HBsAg的检出率达9.8%乙型肝炎病毒感染的现状全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒，中国有1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡。乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，它是由乙肝病毒(HBV)感染引起的。全世界乙肝携带者达5亿之多，我国是乙肝携带者高于人群的10％。急性乙肝中有20%会转为慢性，进而可能发展为肝硬化和肝癌，因此

2、，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后显得极为重要。乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），基因组长度3.2kb目前感染人类最小的DNA病毒部分双链环状DNA。HBV基因及编码蛋白HepatitisBVirus乙肝的实验室诊断（一）生化学检查（二）HBV血清学检查（三）HBVDNA、基因型和变异检查生化学检查ALT和AST血清胆红素凝血酶原时间（PT）及PTA胆碱酯酶血清白蛋白甲胎蛋白（AFP）生化检测的局限性敏感度有限代表肝细胞损害，水平高低不能代表肝储备能力关于“胆酶分离”现象HBV血清学检查项目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗

3、-HBcIgM方法ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay，最常用，定性)发光免疫分析(定量)HBsAg–感染的标志Anti-HBs–既往感染/接种疫苗Anti-HBcIgM–急性感染标志Anti-HBcIgG–既往或慢性感染HBeAg–急性病毒复制，有传染性Anti-HBe–病毒不再复制HBV-DNA–急性病毒复制，比HBeAg更准确；主要用于监测治疗反应血清学检测的临床意义HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc临床意义急性或慢性感染(大三阳)+-+-++++乙肝后期或慢性感染(小三阳)--++---潜伏期或急性乙肝早期--+++痊愈或恢

4、复期,有免疫力-----+++--痊愈,有免疫力疫苗接种或曾经感染过,有免疫力血清学检测的局限性HBV具有“检测窗口期”假阴性结果无法检测突变株及抗体SymptomsHBeAganti-HBeIgGanti-HBcIgManti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100AcuteHBVInfectionwithRecoveryTypicalSerologicCourseWeeksafterExposureTitreIgManti-HBcIgGanti-HBcHBsAgAcute(6months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0

5、481216202428323652YearsWeeksafterExposureTitreProgressiontoChronicHBVInfectionTypicalSerologicCoursePCR技术检测HBVDNAPCR聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。PCR概念PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复

6、制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。PCR反应的特点特异性强引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平简便、快速2小时完成扩增对标本的纯度要求低DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板PCR反应过程DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94C30s退火（annealing）:55C30s延伸（extension）:72C30-60s3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形

7、式增长。普通PCR技术的缺点普通PCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。因此国家卫生部曾在1997年行文禁止将普通PCR技术用于临床诊断。定量PCR的特点采用闭管检测，不需PCR后处理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成。不需开盖，不产生污染。避免了假阳性。探针与被检DNA序列特异杂交，增强了特异性。定量PCR的特点可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感染和治疗恢复情