免疫电泳技术.ppt

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1、免疫电泳技术四川大学华西医院临床免疫室武永康一、免疫电泳技术的发展二、免疫电泳技术的相关概念三、介绍几种经典的免疫电泳技术（重点）四、凝胶免疫电泳技术要点五、免疫增殖性疾病及免疫检测本课内容免疫电泳技术1953年Grabar和Williams将凝胶扩散置于直流电场中，让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运动方向，并与免疫沉淀反应相结合，从而加快了沉淀反应的速度，建立了免疫电泳技术，之后又衍生出对流免疫电泳、火箭电泳、及免疫固定电泳等新方法。一、免疫电泳技术的发展琼脂电泳与免疫扩散沉淀技术相结合的一门技术

2、。(K)1．电泳优点（1）将蛋白电泳分开（2）加快反应速度2．沉淀反应（一）免疫电泳技术的定义二、免疫电泳技术的相关概念免疫电泳分析immunoelectrophoresis蛋白质具有可解离的酸性和碱性基团，在一定PH值条件下，使蛋白质分子带正电荷或负电荷。在电场中，带正电荷的粒子向负极移动，而带负电荷的粒子向正极移动，由于各种蛋白质迁移率不同而分为不同的区带。（二）电泳的基本原理及其影响因素I．基本原理电泳（electrophoresis）:带电颗粒在电场中通过液体介质的移动，称为电泳。1. 颗粒（蛋

3、白）本身特性：两性、大小、形状2.载体性质：最常用的载体是琼脂和琼脂糖凝胶3.电场强度4.溶液PH值及离子强度——缓冲液的作用最适电泳缓冲液0.05M，PH8.6巴比妥缓冲液II.电泳的影响因素5.电渗（主要与载体特性有关）电渗定义电渗方向与电泳方向的关系J电泳迁移率：指在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内移动的距离。6.电源定义：区带电泳+免疫双扩散(K)基本原理：在电场作用下，将标本于琼脂凝胶中进行区带电泳，电泳结束后，于琼脂板旁挖一长形槽，加入相应抗血清，抗体呈直线扩散，电泳分离后的各种抗原

4、呈放射状扩散，反应生成弧状沉淀线。1.免疫电泳三、介绍几种经典的免疫电泳技术免疫电泳将蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，使不同的抗原彼此分离。撤去电压，在与电泳方向平行的琼脂打槽并加入相应抗体进行双向免疫分散。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成弧形沉淀线。据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的正常人沉淀线比较，即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。(K)免疫电泳操作步骤：结果复杂(经验判断)可不生成沉淀线（浓度太高或太低），或沉淀线重合技术评价：（1）Ig量

5、及单克隆性与沉淀线致密度关系（2）Ig量与抗体槽距离之间的关系：抗原抗体最适比关系结查分析（K）血清蛋白的分析，如多发性骨髓瘤、r球蛋白缺乏症应用：2.对流免疫电泳定义：定向加速度的免疫双扩散技术（K）对流免疫电泳示意图在pH8.0的缓冲液中，蛋白质抗原带负电荷向正极泳动；而抗体Ig由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。电渗：指在电场中液体对于一个固定介质的相对移动。出现沉淀线→洗涤、染色、分析结果对流免疫电泳操

6、作步骤：制琼脂板→打孔→加样→电泳AbAg高电渗为特点，但电渗过强会使蛋白质向阴极移动（K）对流免疫电泳简便、快速、敏感度较高抗原、抗体比例要求严格抗原或抗体PI相近或迁移率非常接近，不宜做对流免疫电泳技术评价：可用于乙肝病人血清鉴定；甲胎蛋白的测定，但近年多以ELISA替代。应用：定义：加速度的单向扩散（J）3.火箭免疫电泳火箭免疫电泳示意图－标准曲线测定样本含有抗体的琼指基本原理：琼脂凝胶中的抗体不发生移动(K)，样品孔中的抗原向正极泳动，随抗原含量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原

7、抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰。制备含抗体的琼脂板(K)→打孔→加样→电泳→出现火箭形沉淀线→洗涤、染色、分析结果火箭免疫电泳操作步骤：“峰高——浓度标准”曲线：以不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量。唯一的定量方法（K）火箭免疫电泳的定量测定l．电渗小2．电泳终点时间较难掌握3．开启小电流后再加样，否则形成宽底峰4．IgG电泳应先将其甲酰化，使只带负电荷火箭电泳操作时应注

8、意以下几点：PH8.6时，分析蛋白质抗原带有负电荷免球测定应先甲酰化，以增加其净负电荷量技术评价：大多数蛋白质均可用这一方法进行测定，但目前已被敏感度高，特异性好的ELISA等方法代替。应用：基本原理：将抗血清直接加于电泳后蛋白质区带表面，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合而固定的某种蛋白。5.免疫固定电泳(K)（immunofixationelectrophoresis。IFE）（IgA型MM）