基因定量分析系统-焦磷酸测序 [兼容模式].pdf

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1、基因定量分析系统－焦磷酸测序凯杰生物陈永亮ForInternalUseOnlySample&AssayTechnologies焦磷酸测序介绍.什么是Pyrosequencing?n基于实时技术的定量测序方式（精度：1％～5％）n简单可靠n没有样本分离、凝胶和探针n灵活o通量灵活（样本数量随意）o检测设计灵活o应用种类灵活（一次可以做多个分析）SequencingbySynthesisRonaghiM.,UhlénM.,NyrénP.(1998)Real-TimePyrophosphateDetectionforDNASequencing.Science281:36

2、3-365PyrosequencingisthemethodofchoicewhenevershortormediumDNAsequencesneedtobaanalyzedwithhighprecisionandinaquantitativemanner在任何短片段或中等片段DNA序列需要高精度和定量分析的时候，焦磷酸测序是一种可行的方法ForInternalUseOnly-2-Sample&AssayTechnologies.焦磷酸测序原理.焦磷酸测序流程.焦磷酸测序的应用及举例.焦磷酸测序设备.小结ForInternalUseOnly-3-Sample&As

3、sayTechnologiesPyrosequencing-Technologyoverview焦磷酸测序技术介绍第一步：加入测序引物和试剂第二步:每次加入一种dNTP，如果结合，则产生一个焦磷酸（PPi）light第三步：硫酸化酶转化PPi为ATP，ATP使荧PPi光素酶发出荧光(产生的光强度与结合的核苷数量成正比)ATPLight第四步：多余的dNTP被降解，开始新一个循环time主要特点：基于实时测序技术的检测和定量ForInternalUseOnly-4-Sample&AssayTechnologiesForInternalUseOnly-5-Sample

4、&AssayTechnologiesPyro技术原理Pyrogram™的产生Example:SNPGenotyping例如：SNP基因分型nSequencetoanalyze:待分析的序列a/gCTGCCTnDispensationorder:分配顺序Ca/gTCTGCTSingleheightrefpeaksDoubleheightrefpeakCAGTCTGCTNegativecontrols阴性ReferencePeaks参考峰ForInternalUseOnly-6-Sample&AssayTechnologiesPyro技术原理Pyrogram™的产生E

5、xample:SNPGenotyping例如：SNP基因分型nSequencetoanalyze:待分析序列a/gCTGCCToGenotype:基因型A/GHeterozygoteDoubleheight2halfheightpeaksSingleheightrefpeaksrefpeak两倍高两个半高峰单个高度的参考峰度的参考峰CAGTCTGCTNegativecontrols阴性ReferencePeaks参考峰ForInternalUseOnly-7-Sample&AssayTechnologiesPyro技术原理Pyrogram™的产生ACTGCCT--

6、------TGACGGA---HomozygousA纯合子AACTGCCT--------TGACGGA---AGCTAGGCTGCCT--------CGACGGA---HomozygousG纯合子GGCTGCCT--------CGACGGA---AGCTAGACTGCCT--------TGACGGA---HeterozygousA/G杂合子A/GGCTGCCT--------CGACGGA---AGCTAGForInternalUseOnly-8-Sample&AssayTechnologies密码子12/13发生变异的病人结果Sequencetoana

7、lyze:GGTGGCGTAGGA:44%Codon12mutation:C:0%G:56%A:1%GGTGATT:0%G:99%200Patientno.41000ESTACGACTCAGATGCGTAGA:0%C:0%Codon13mutation:G:100%A:40%GGCGACT:0%G:60%300200Patientno.51000ESTACGACTCAGATGCGTAGA:0%C:0%G:100%A:0%wtK-RasT:0%G:100%150Patientno.6100500ESTACGACTCAGATGCGTAGDataprovidedbyDr

8、Magnu