碱基序列标记法结合焦磷酸测序测定不同来源基因表达量

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1、碱基序列标记法结合焦磷酸测序测定不同来源基因表达量作者：张晓丹武海萍　陈之遥　周国华【摘要】建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称“SRPP”)。先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签，PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码，使得测序结果中的序列代表基因的来源，峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证，结果表明，SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量，并实际测定了Egr1基因在糖尿病

2、、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。【关键词】序列标记反转录,聚合物链反应，焦磷酸测序，基因表达　　1引言　　差异表达基因与疾病密切相关，深入研究可在基因水平揭示疾病的发病机制。目前，用于检测基因表达水平的技术主要有SAGE法[1]、实时荧光定量PCR法[2,3]和基因芯片法[4]等。但这些方法存在仪器设备昂贵、定量性能差以及同时测定基因表达量的来源数目受限等缺点。14　　焦磷酸测序技术是新近发展起来的一种基于酶催化化学反应的测序技术[5～8]，不需要使用荧光标记，定量性能好。目前，焦磷酸测序技术多用于单核苷酸多态性(SNP)分析、微生

3、物分型和基因甲基化分析等。本研究将焦磷酸测序技术用于基因表达量差异的比较分析，考察了其可行性和准确性，并将其应用于检测Egr1基因在糖尿病、肥胖症和正常小鼠中的差异表达。2实验部分　　2.1仪器、试剂与材料　　21R型台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司);GeneSpeⅢ微量核酸蛋白测定仪(日本NakaInstrument公司);PTC225PCR扩增仪、Opticon实时荧光PCR仪(美国MJResearch公司)。焦磷酸测序装置由本实验室自行组装[9,10]。此装置主要由焦磷酸测序反应模块、荧光信号放大和数据采集3部分组

4、成。反应模块由位于中间的反应池通过毛细管与四周的dNTP储液池相连组成。通过注射器施压使4种dNTP循环加入反应池完成测序反应。荧光信号通过R6335光电倍增管(日本HamamatsuPhotonicsK.K.公司)放大后，经BPCL微弱发光测量仪(北京中国科学院生物物理研究所)采集数据。14　　HotstarTaqDNA聚合酶、OmniscriptRTkit反转录试剂盒(德国Qiagen公司);Trizol(上海Inviotrogen公司);荧光素、荧光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和5′磷酸化硫酸腺苷(美国Sigm

5、a公司);DynabeadsM280链霉亲和素磁珠(挪威DynalAS公司);KlenowDNA聚合酶(美国Promega公司);所有引物均由上海Invitrogen公司合成。　　实验中用到的糖尿病、肥胖和正常小鼠的肝组织由南京师范大学生命科学学院提供。　　2.2RNA的提取　　用Trizol试剂盒抽提RNA，用紫外分光光度法测定RNA浓度及纯度。　　2.3反转录合成cDNA第一链　　取等量的不同来源的总RNA，分别以来源特异性反转录引物反转录。即取总RNA0.05～2.0μg至Nucleasefree的小管中，加DEPCH2

6、O至12μL;65℃反应5min后，置冰上至少1min;在上述各小管中加入10×第一链合成缓冲液2μL，0.5mmol/LdNTP混合物，10URNase抑制剂，200UOmniscriptReverseTranscriptase，1μ14mol/L反转录引物，加DEPCH2O至总体积为20μL。反转录条件为：37℃反应1h,93℃反应5min，然后中止反应。　　2.4基因特异性PCR　　不同来源的cDNA等比例混合，以共用引物CP(5′CCATCTGTTCCCTCCCTGTC3′)和生物素标记的基因特异性引物(GSP)进行扩增

7、反应。PCR体系为：cDNA等比例混合液1μL，0.3μmol/LCP和GSP，1.5mmol/LMg2+，0.2mmol/LdNTP混合物，10×PCR缓冲液5μL，5×Q溶液10μL，1UHotStarTaqDNA聚合酶，并加入灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序为：94℃变性15min，热循环35次(94℃,40s;60℃,40s;72℃,1min)，72℃延伸10min，4℃保存。基因特异性引物的序列见表1。表1实验用引物　　2.5焦磷酸测序固相单链模板的制备　　取5μL戴诺磁珠(Dynabeads)，用磁铁吸弃上清液。磁珠以

8、100μLB&WBuffer(10mmol/LTrisHCl,pH7.5,1mmol/LEDTA,2.0mol/LNaCl)洗涤两遍，最终悬浮于50μLB&W缓冲液中;加入50μLPCR产物，37℃反应