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1、第二讲基因组测序与序列组装主要内容:什么是基因组什么是基因DNA测序的方法DNA序列的组装人类基因组计划水稻基因组计划后基因组学1.什么是基因组基因组就是一个物种中所有基因的整体组成。基因组有两层意义：遗传物质和遗传信息。要揭开生命的奥秘，就需要从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。Zeamays8,000Homosapiens3,000Oryzasativa400Drosophilamelanogaster165Arabidopsisthaliana100Saccharomycescerevisiae
2、12E.coli4.6GenomeSize(Mb)什么是C值？通常是指一种生物单倍体基因组DNA的总量.在真核生物中，C值一般随着生物的进化而增加，高等生物C值一般大于低等生物。C值悖理：生物的复杂性与基因组的大小并不完全成比例增加细菌真菌等动物阴影部分为一个门内C-值的范围重复顺序高度重复顺序：长度：几个——几千个bp拷贝数：几百个——上百万个首尾相连，串联排列集中分布于染色体的特定区段（如端粒，着丝粒等）也称卫星DNA中度重复顺序：一般分散于整个基因组中；长度和拷贝数差别很大单一顺序：基因主要位于单一顺序动物中单一顺序约占5
3、0％植物中单一顺序约占20％是遗传信息的物理和功能单位，包含产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。基因分类：编码RNA的基因，如rRNA基因，snRNA基因等；编码蛋白质的基因2.什么是基因？基因的不连续性Intron和Exon:大多数真核生物蛋白质基因的编码顺序(Exon)都被或长或短的非编码顺序(Intron)隔开基因家族一群具有一致的或相似顺序的基因,有的还担负类似的生物学功能,可以相互补偿,比如:E2ftranscriptionfactorMousesymbolHumanOrthologE2f1E2F1E2f
4、2E2F2E2f3E2F3E2f4E2F4E2f5E2F5E2f6E2F6假基因(Pseudogene)来源于功能基因但已失去活性的DNA序列产生假基因的原因有:由重复产生的假基因;加工的假基因,由RNA反转录为cDNA后再整合到基因组中;残缺的基因(Truncatedgene)重叠基因:同一段DNA能携带两种不同蛋白的信息.重迭基因有以下几种情况：*一个基因完全在另一个基因内部*部分重叠*两个基因共用少数碱基对*一个基因完全在另一个基因内部如：B和A，E和D其读码结构互不相同---ATG-----//------AATGCC-
5、---//---ATAACG---//--TAA----A*BATGCCN----NNATAA*部分重叠如：K和C*两个基因共用少数碱基对如：D和J-------TAATG-------D终止密码子J起始密码子3.DNA测序的方法链终止法测序化学降解法测序自动化测序非常规DNA测序3.1链终止法测序(thechainterminationmethod)基本原理:通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。技术路线与要求制备单链模板
6、↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列A克隆于质粒中DNA→用碱或热变性BM13克隆单链DNAC噬粒克隆DNADPCR产生单链DNAA高酶活性B无5’→3´外切酶活性C无3´→5´外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子连接的是氢原子,不是羟基3.2化学降解法测序基本原理:在选定的核苷酸碱基中引入化学基团，再用化合物处理，使DNA分子在被修饰的位置降解。技术路线将双链DNA
7、样品变为单链↓每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记，以便显示DNA条带↓分别用不同方法处理，获得只差一个核苷酸的降解DNA群体↓电泳，读取DNA的核苷酸顺序Maxam-Gilbert法所用的化学技术碱基特异修饰方法GPh8.0,用硫酸二甲酯对N7进行甲基化,使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去C1.5mol/LNaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶化学法测序实例哌啶3.3自动化测序基本原
8、理与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddCTP标记蓝色荧光,ddGTP标记黄色荧光,ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.3.4非常规测序毛细管电
