基因组学 课件 4基因组测序与序列组装.ppt

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1、基因组测序与序列组装中英联合实验室中英联合实验室基因组测序与序列组装基因组计划的最终目标是获得所研究的生物的完整的DNA顺序。最佳状况是将物理图谱和遗传图谱进行有机整合，以确定基因以及其他重要的序列在DNA顺序中的位置。主要内容：1.DNA测序的方法2.DNA序列的组装3.基因组测序的其他路线4.人类基因组的测序和组装中英联合实验室4.1DNA测序的方法DNA测序技术主要有两种方法，都是在20世纪70年代中期发明的。A.双脱氧链终止法（thechainterminationmethod），是通过合成与单链DNA互补的

2、多核苷酸链来读取待测DNA分子的顺序。B.化学降解法（chemicaldegradationmethod），是将双链DNA分子用化学试剂处理，产生切口，用同位素标记进行测序。中英联合实验室A.双脱氧链终止法原理：DNA复制：模板DNA、DNA聚合酶、引物、4种dNTPddNTP的加入：在反应系统中加入双脱氧（碱基）核苷三磷酸（ddNTP），只要双脱氧核苷酸掺入3’端，该链就停止延伸，链端掺入单脱氧核苷酸的片段可继续延伸。如此得到3’端终止于ddNTP的一系列长度不等的核酸片段4个反应体系中分别加入4种不同的ddNTP

3、，浓度低于dNTP。反应终止后，分四个泳道进行电泳（聚丙烯酰胺凝胶），分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。中英联合实验室A.双脱氧链终止法双脱氧链终止法测序的原理中英联合实验室A.双脱氧链终止法双脱氧链终止法对DNA多聚酶的要求：高酶活性无5’－3’外切核酸酶活性，5’－3’外切核酸酶使DNA聚合酶去除已存在的链无3’－5’外切核酸酶活性，3’－5’外切核酸酶使DNA聚合酶校正自身错误天然的DNA聚合酶不能满足，需要进行改造Klenow聚合酶

4、：来自大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，外切酶活性去除，酶活性不够，250bp测序酶Sequenase：噬菌体T7编码中英联合实验室A.双脱氧链终止法双脱氧链终止法要求单链作为模板：将DNA克隆到质粒载体中：碱变性或热变性变为单链，双向测序；污染，干扰以M13载体克隆单链DNA：无需变性，直接测序；>3kb，扩增时容易发生丢失与重排，小片段DNA测序以噬菌粒（phagemid）克隆DNA：改造的质粒载体，2个复制起始点（质粒自身和M13单链噬菌体），在大肠杆菌细胞中产生单链噬菌粒，>10kbDNA测序PCR产生单链DNAPCR

5、制备单链DNA中英联合实验室A.双脱氧链终止法通过M13载体获得单链DNA以测序：是利用M13噬菌体在体外能以单链形式存在。将待测序DNA片段连接到M13载体中去，再利用引物，进行DNA合成，并在合成系统中加入ddNTP中英联合实验室A.双脱氧链终止法双脱氧链终止法中引物的影响：引物决定了模板链的测序起点，一般来说，是采用克隆位点附近载体上的一段顺序。A.通用引物：与载体DNA中附近插入片段的顺序退火，可引入新链的合成。B.内部引物：提供一系列端部以及内部可完成长序列顺序的克隆。中英联合实验室B.化学降解法基本原理：

6、在选定的核苷酸碱基中引入化学基团，再用哌啶处理使DNA分子在被修饰的核苷酸位置降解。同时完成4组反应，A、G、C、T链终止法：主流技术，易于机械化自动控制化学降解法：试剂含有毒性主要原因是链终止法。测序技术的发展放射性同位素标记底物：灵敏度高荧光标记物：灵敏度与分辨力，便于仪器阅读。一种碱基一种颜色（A红色，G黄色，C蓝色，T绿色）毛细管电泳：取代聚丙烯凝胶平板电泳，96个泳道，每次可同时进行96次测序，每轮实验不到2小时，1天可完成近千次反应光点测序pyrosequencing：无须电泳，每连接dNTP时释放1个焦

7、磷酸，焦磷酸在磷酸化酶的作用下转换为化学能，发出光亮。每次只加入1种dNTPDNA芯片测序：将各种排列顺序的寡聚核苷酸点在芯片上，DNA分子与芯片温浴，能杂交的寡聚核苷酸都会在确定位置发出信号，获取信息进行对比组装。中英联合实验室最新进展：经济快捷的DNA染色测序法2005年4月，美国columbia大学的科学家给4种碱基染上不同的颜色，然后从人类p53基因中抽取一个由12个碱基组成的片段，运用分子生物学技术使染色的碱基排列成与该DNA片段互补的一个新片段。传统DNA测序的方法有毛细管微阵列电泳测序和焦磷酸测序等，这

8、些方法技术要求较高、成本昂贵，而且容易出错。相比而言，新方法通过逐个观察DNA片段上碱基的颜色来确定其序列，精确度极高。对这项研究提供资助的美国国家人类基因组研究所希望，在10年内将哺乳动物的基因测序成本从1000万美元降低到1000美元，这样就有可能以廉价的成本对患者进行“量身定做”的基因治疗。中英联合实验室4.2DNA序列的组装将大量短的D