资源描述：
《confocal原理-本科生实验02.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、激光扫描共聚焦显微镜原理及应用2009年10月Confocal原理及应用Confocal原理什么是Confocal？LSCM（LaserScanningConfocalMicroscope）激光扫描共聚焦显微镜1955年，MarvinMinsky为了观察活体脑组织中的神经网络，首次提出了共聚焦显微镜的基本原理1）激光作光源；2）扫描成像；3）共聚焦光路设计；4）荧光显微镜Confocal原理荧光显微镜落射荧光光路(EPIFluorescenceOptics)Confocal原理激光光源激光光源具有如下优点：1）单色光；2）高强度；3）方向性好（
2、点光源）；4）偏振光多线氩离子激光器(457，477，488，514nm)氦氖激光器(543，594，633nm)固体激光器（408，488，561，640nm）Confocal原理激光光源激光器Confocal原理扫描成像LSCM采用逐点成像方式，通过软件重建出完整视野采用X，Y扫描振镜精确控制激光点的位置，对整个视野进行扫描Confocal原理Confocal光路针孔的采用，是Confocal光路的关键所在ThreePointsApointlightsourceforilluminationApointlightfocuswithinthe
3、specimenApinholeattheimagedetectingplane－针孔正好位于物镜焦平面上的点所成像的位置；－针孔起到一个很好的“过滤”作用，挡掉来自非焦平面上信号的干扰Confocal原理Confocal光路PMTConfocal原理PMTPMTConfocal光路PMTConfocal原理Confocal光路PMT原理Confocal原理PhotomutiplierTubeConfocal原理PMT原理通过衍射形成图像。在物镜共轭平面探测图像。分辨率和对比度由相同的因素决定。显微镜的光学装置的选择标准相同。像差对图像的影响相
4、同宽场图像在整个视场同时形成，共聚焦显微镜图像是一个像素一个像素进行扫描获得的。宽场图像在图像平面成一实像。共聚焦图像只是暂时存在于图像共轭平面。共聚焦图像在空间上通过共聚焦针孔来过滤。相似点不同点Confocal原理confocal和普通显微镜的异同点Confocal原理Confocal和普通宽场荧光图像比较Confocal原理Confocal和普通宽场荧光图像比较Confocal原理Confocal的优点Confocal原理NikonC1Si所采用的技术Confocal软件界面整体Confocal软件拍摄界面选择激光选择探测通道设定扫描分辨
5、率预览（图像连续更新）调节焦距，设定扫描区域调节针孔调节象素扫描时间调节每个通道的增益调节激光强度Confocal软件激光波长选择408nmDapi,CascadeBlue,BFP,CFP440nmCFP,FuraRed,LuciferYellow488nmGFP,Alexa488,FITC,DiO514nmYFP,TOTO-1,CalciumGreen543nmDSRed,Cy3,TRITC,DiI594nmAlexa594,TexasRed640nmCy5,TOPRO-3,DRAQ-5Confocal软件得到最佳图象效果通过调节Gamma,
6、饱和度,和darklevel，使图像显示和伪彩色显示相匹配,得到最佳图像显示质量.Confocal软件Zstack序列图象软件可以根据物镜选择最佳步径。在您想要拍摄的stack范围内选择一个切面，得到优质图象。选择感兴趣范围选ref，点红色按钮设置参考位置调节焦距，设置顶部和底部位置，注意过饱和指示，优化增益值选择Z-stack必要时选择Average提高信噪比调节分辨率点single获取Z-stack图象Confocal应用应用分类Confocal的应用大致可以分为3类：1）常规应用：这类应用通过普通荧光显微镜也可以实现，但Confocal要
7、做的更好或者好得多；2）专有应用：这类实验利用了Confocal专有的特性；3）光谱应用：利用Confocal的光谱特性设计实验Confocal应用常规应用利用Confocal进行空间定位：1）免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位如：细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位；2）细胞凋亡机制；3）荧光原位杂交,杂色体基因定位；4）细胞骨架装配：分析正常及癌变细胞中细胞骨架与核改变之间的关系；5）细胞黏附行为……Confocal应用常规应用多个荧光通道的叠加：Confocal应用常规应用荧光通
8、道和DIC通道的叠加：BuddingyeastcellsExpressingafusionofGFP(S65T,V163A)totheendoplas
