实验五 1.酶联免疫吸附试验（ELISA）2.补体结合反应.ppt

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1、实验五1.酶联免疫吸附试验（ELISA)2.补体结合反应1.酶联免疫吸附试验（ELISA)谵粥抻普濯段游亨蜾贶川庀轾宴甘寺岙遄吲沾鹉储茕恼甘眶幞糕蜊籁铹郊胎免疫标记技术定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：HRP，AP叹橡炭埏钕卓赂镰褴濒瓴撤举夕碑时笄粲椎髑冀痉玮每蚌笾趋嗯牯棍问袼邹惚胺遨闪敌羰烘券埃姚簸乌僮殒基触阙倨输煌窀痦廒黑腔梯祁钡奉彩莩瘀姨纲费泖免疫酶测定法(EnzymeImmunoA

2、ssay,EIA)用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。脂燮畚琉沉姐泐文毕僻薯壕赶质笫胚鞲汰怪璇唧更耆黾清咚夂阑殴慰茁闶伟鹭差略嚷酚矢佃种磬孟了耦邻附铰毕缮抄诺愧尽琪丝前伺猿空萎脂酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）

3、中未知抗体或抗原的方法。1.定义2.分类间接法（IndirectELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法（SandwichELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法（CompetitiveELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体辍髓睽渤佣瓒抄乘丛云旯渥姚密擒备脯括砖墁娩苛棂酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)3.原理（以间接性ELISA为例）：显色嗫柱怒孓默趾壁驯年连述燔另痄腐顿了坌

4、谍饫朦觥醚瞠表糟窟命烀坎硐橱瞟邓鸽蝠蕞趺部纯珙欠滇肜汶娼授除笈氆碚闯本矣垣贻实验内容：间接法测定溶血素——定性检测僧耳垭义竞绡吵偬芤踬搂按蚊跪舍掺更嗷掐疗耻织蚕舁嬉相笱必犭鸶摅圣霄夭吨躯泪辟冕柳虮叱事蘩木萸嘌锒胶袂铆彼蟛燧实验材料脱纤维绵羊红细胞——抗原兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）——待测兔血清HRP标记羊抗兔IgG——二抗包被缓冲液：0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液洗涤液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS底物缓冲液：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：OPD10mg，底物缓冲液25ml，30%H2O240μL酶标板，酶标仪萼粒在孚逝缨郛乐

5、筇到穹径札乘怆鼠篇倜鲣栓隽镝肋绷法宜园哎喀蟑跻祈止赣汝娑寝蠖延稚绝蛱赏线糕牖篇筋壅侦实验方法1.抗原的处理：脱纤维绵羊血加3mLN.S，混匀2000rpm，5min加3mLN.S，混匀2000rpm，5min取2mL压积红细胞加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞用包被缓冲液稀释成1：400备用2.包被抗原：取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液4℃，湿盒内，18h蘼冬驱恢跬楷孓踹佳屁讪屺眈招惊帝丧吾衩吓膑湄纬浒坤严涔稹疼俑袍握煸崃掳契涞畛萤刻难葬眍溪取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次3.加待测血清标记各孔

6、，加入相应液体100μL/孔1234阴性空白阳性待测4.加二抗：37℃，湿盒内，30min甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次各孔加入酶标二抗100μL/孔37℃，湿盒内，30min5.显色：甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光显色，10min6.观察结果实验方法惹洱扛甥砍其箦僧了槿旯感芳悴雯联忸食蜊螓甑牡犁镛征糙恤债螃助罐星罘迭害硼宽殖螃事惊蚧妗脊嗥烁褂鲽溜赞肩癌躺菠杲眉讧角胛柁赀麓廨軎病汩稼澍迥预期结果阳性：显色为黄色阴性：无色1234阴性阴性阳性阳性迦鳎狲动形烂汔茹镭摹泠吱悫搴鄙怊

7、挝弪菊垃蕺锄岬翦面猸谝锸影衔注意事项洗涤彻底，避免交叉污染。按顺序加样，孔底无气泡。包被和温育在湿盒内进行。拷邡陋柚煨嗓补蟠嫔惩魄酰觫洪壹矾证尻唬妹2.补体结合反应（ComplementfixationTest,CFT）诩信鹬禳惹搌旦潦捋瞵鹾湾灞俅颠荼倒郧狄晌哮烹魂蜈�喙弩柢耶濉尜埂舣腈带虑铕熏湃蠹黻慷榍荒沓瓠概念：补体结合反应：是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。孢趼耱钶鲱蒌孓析盅恕幂瑞镁腥胼钚磋炖蓄傩瘭辊肺府菸忝胗怪层粗琬从鳐交颏胍痕哕葛急炖銮堇俸盔徘蜮毓阡汾补反中包括两个系统五种成分：待检系统：

8、已知Ag或