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《环氧合酶2在非酒精性脂肪肝病中的表达及意义.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、环氧合酶2在非酒精性脂肪肝病中的U!表达及意义【摘要】目的：探讨环氧合酶2(cyclooxygenase2,COX2)在大鼠非酒精性脂肪肝(NonalcoholicFattyLiverDisease,NAFLD)中的表达及意义.方法:建立大鼠NAFLD动物模型，用免疫组化，RTPCR,Westernblot检测COX2在NAFLD中的表达.结果：光镜下模型组肝损伤明显，治疗组较轻.模型组血清白细胞介素1(IL1)及肝组织血栓素B2(TB2)比正常组明显升高(P<0.05),与模型组相比，治疗组大鼠血清IL1及肝组织TXB2
2、明显降低(P<0.05);肝组织6KetoprostaglandinFla1pha(6kPGF1ot)模型组较对照组低(P<0.05),治疗组较模型组升高；正常组大鼠肝细胞中COX2mRNA几乎无表达，模型组表达阳性，与正常组比较明显升高(P<0.05);模型组COX2蛋白含量较正常大鼠增高(P<0.05);经Celecoxib治疗后，同8,12wk组比COX2的表达减弱(P<0.05).结论：COX2介导的酶活性增加，启动脂质过氧化反应，促进脂肪肝的形成和发展；应用特异性COX2抑制剂，下调COX
3、2的表达，阻断氧应激，可减轻NAFLD的肝损害.【关键词】非酒精性脂肪肝前列腺素内过氧化物合酶白细胞介素16酮前列腺素Fla血栓烷B2大鼠0引言celecoxib是特异性的环氧合酶2(COX2)抑制剂，对COX2的选择性抑制强度是对COX1抑制作用的375倍[1].本实验通过建立大鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)动物模型，研究COX2在非酒精性脂肪肝损伤中的作用，以便进一步探讨其在NAFLD中的致病机制.1材料和方法1.1材料TRIZoL试剂盒(Invitrogen公司)，MMLV第一链cDNA合成试剂盒(Invitrogen公司
4、)，TaqDNA聚合酶(华美公司),RT及荧光定量PCR试剂盒(RTPCRKit,大连宝生物工程有限公司)，内参照GAPDH和
5、3actin(博奥森)，Celecoxib(美国Searle公司，进口注册号H20050351);兔抗鼠COX2多克隆抗体，浓度1：100(Santa公司)；山羊抗兔多聚体，SABC试剂盒及COX2免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司).TC150基因PCR扩增仪(美国MJResearch)・1.2方法1.2.1动物模型制备及分组成年雄性SD大鼠40只，随机分为正常对照组(n=8)和非酒精性脂
6、肪肝模型组(n=32)[2].非酒精脂肪肝模型组又随机分为4(n=8),8(n=8),12wk组(n=16).12wk组又随机取8只于处死前最后14d用灌胃法给予Celecoxib10mg/kg(Celecoxib组).所有动物均给以普通饲料、自由饮水.非酒精性脂肪肝模型组每天ig含20g/L乳清酸、40g/L胆固醇、80g/L猪油、4g/L蛋黄粉的脂肪乳剂，每次1mL(100g),早上用脂肪乳剂，晚上用生理盐水灌胃.1.2.2血清及肝组织标本制备经耳缘静脉注射30g/L戊巴必妥钠溶液麻醉大鼠，经腹主动脉取血4~6niL,分离血
7、清保存在-7(TC冰箱中待测血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,ALT天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST)及IL-1含量.处死大鼠后，将肝脏完整的分离出体外，取肝右叶约100mg,用生理盐水溶液制成40g/L的组织匀浆液后，离心后取上清液，-70°C冰箱内保存待测6kPGFlot和TXB2的含量.再取肝脏右叶组织多聚甲醛中固定，石蜡包埋切片，作HE染色和免疫组化.1.2.3免疫组化检测COX2应用MPIAS多媒体彩色病理图纹分析系统分析COX2相对
8、积分光密度值，每组每张切片随机选取5个视野，像素点0.389Mm,在9.306x104从m测量窗下测量并记录COX2相对积分光密度值.1.2.4肝组织COX2mRNA的表达应用RTPCR技术检测COX2mRNA在NAFLD中的表达，用TRIZOL试剂盒提取肝组织总RNA,紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度.在逆转录酶MMLV的催化下合成cDNA,取5pLcDNA为模板在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增.COX2的mRNA引物由上海生工生物公司设计并合成.COX2:正链5'ATGGCTGCAGAGTTGAAAGC3',负链5
9、，CTCTTACAGCTCAGTTGAACGC丁,特异扩增片段为430bp;GAPDH:正链57AGATCCACAACGGATACATT3’，负链5’TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3’，产物为308bp.扩增条件为：94°C预变性2min,94°C变性
