酶消化法分离培养小鼠胎儿成纤维细胞.doc

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1、酶消化法分离培养小鼠胎儿成纤维细胞酶消化法分离培养小鼠胎儿成纤维细胞%1.实验日的掌握消化分离培养小鼠胎儿成纤维细胞的基木方法及原理。%1.实验原理胰蛋门酶消化液包括胰蛋门酶和EDTA0胰蛋门酶是…种消化酶，它通过作用于精氨酸或赖氨酸之间的肽键，能破坏细胞间的连接，进而从组织块屮分离获得单个细胞；细胞之间是通过CAM（细胞粘性分子）相连，而很多粘性分子只有在+2价金属离子，如Ca2+.Mg2+的存在下，才能行驶这种功能，在胰蛋口酶中加EDTA的作用是熬合这些二价离子，使细胞被消成单细胞状态；木实验就是采用胰蛋门酶和EDTA消化小鼠胎儿肌肉组织获得单个细胞。实验器材试

2、剂：10%犊牛血清（NBS）的1640培养液，0.25%胰蛋门酶-0.04%EDTA,PBS（一）器械：离心机，滴管，普通天平，手术器械，载玻片，离心管等材料：怀孕小鼠13.5天母鼠%1.实验步骤1.取材：断颈处死孕鼠,腹部向上置于解剖盘中。碘酒消毒1-2次,75%酒精脱碘。剪开腹壁，更换手术器械，取胎儿置培养皿中。2.易9除和清洗：从子宫屮挤出胎儿，剪去胎儿头、尾、四肢、内脏和脊柱后，反复用PBS冲洗3-4次。3.剪碎：将冲洗T•净后的胎儿组织块置另一培养皿中，剪碎至1mm3o4.消化：加入4mL0.25%胰蛋白酶消化液,37C消化5-7mino5.终止:加入4m

3、I含10%NBS的1640培养液终止消化。6.收集细胞：离心用100U滤沙将细胞悬液过滤至离心管中，平衡，离心（lOOOrpm,5min）。7.制备细胞悬液：弃上清，加入51含10%7BS的1640培养液，吹打成细胞悬液。1.细胞形态观察：取载玻片一张，滴细胞悬液一滴，盖上盖玻片，显微镜下观察。1.细胞计数：按照上一实验介绍方法计数。2.培养细胞：将稀释至IX105个/ML细胞悬液加入培养H1L或培养瓶，置于5%CO2,37°C,75%湿度培养屮培养。五.作业1.观察小鼠胎儿成纤维细胞2.撰写实验报告实验结果的看法分析：1.短颈处死孕鼠，无菌操作取出胎儿2.剪碎胎儿

4、组织至lmm33.掌握培养小鼠胎儿成纤维细胞的步骤和方法