DB34∕T 2812-2017 水稻稻曲病菌PCR快速筛查法.pdf

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1、ICS65.020.01B16DB34安徽省地方标准DB34/T2812—2017水稻稻曲病菌PCR快速筛查法PCRRapidScreeningMethodofUstilaginoideavirens(Cook)Takahashi文稿版次选择2017-03-30发布2017-04-30实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2812—2017前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院、安徽省农科院植物保护与农产品质量安全研究

2、所。本标准主要起草人：陈雪娇、李云飞、宗凯、杨雪、孙娟娟、陈雨、郑海松、余晓峰、姚剑。IDB34/T2812—2017水稻稻曲病菌PCR快速筛查法1范围本标准规定了水稻种子中稻曲病菌的PCR快速筛查法。本标准适用于水稻种子中稻曲病菌的快速筛查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3基本信息学名：水稻稻曲病菌。无性态为Ustilaginoideavirens(Cook)Takahashi，子囊菌门

3、（Ascomycota），粪壳菌纲（Sordariomycetes），肉座菌目（Hypocreales），麦角菌科（Clavicipitaceae），绿核菌属（Ustilaginoidea）。有性态为稻麦角菌Clavicepsoryzae-sativaeHas。别名：假黑穗病、绿黑穗病、青粉病等。传播途径：该菌以菌核和厚垣孢子的形式在病残体上或土壤中越冬，可随种子进行长距离传播。见附录A。4方法和原理本标准是通过洗涤法收集可能夹杂在稻种中的水稻稻曲病菌孢子及其DNA，利用水稻稻曲病菌特异性引物对孢子释放的DNA进行PCR扩增，通过能否得到特异性条带判定稻种中是否带有水稻稻曲

4、病菌。5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备往复式振荡器、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、旋涡振荡器等。5.2主要试剂吐温20，无菌去离子水，商品化2×PCR反应预混夜，琼脂糖，TAE，LoadingBuffer，EB。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682的规定。6鉴定方法1DB34/T2812—20176.1洗涤将稻种混匀后称取50g倒入经干热灭菌的250mL三角烧瓶中，加入100mL无菌去离子水和一至二滴表面活性剂吐温20，用封口膜封口。将三角烧瓶放在往复式振荡器上振荡10min后取下

5、三角烧瓶，将悬浮液注入干热灭菌的10mL～20mL刻度离心管内离心（4000rpm/min）5min。取出离心管，弃上清，再加剩余悬浮液，重复离心，直至所有悬浮液离心完毕，留沉淀物及少量上清液（总体积不超过500μL）。弃上清过程中尽量动作轻柔，避免沉淀物悬浮。6.2孢子裂解将6.1中沉淀物及上清液悬浮混匀，连管一起置于沸水浴15min。冷却后备用。6.3PCR特异性检测6.3.1DNA模板将6.2中制备的孢子裂解产物直接作为稻曲病菌PCR特异性检测的DNA模板。6.3.2引物针对水稻稻曲病菌与其他属种病菌ITS序列差异设计了一对特异性引物。uvr-F：5’-CTTGTGT

6、TTTCCAATGCATGT-3’；uvr-R：5’-CAAGTGCGAGGATAACTGAAT-3’。引物由提供商品化服务的公司合成。该引物PCR扩增的特异性条带大小为346bp。6.3.3反应体系用uvr–F和uvr–R对分离纯化的菌株DNA进行PCR反应，反应体积50μL:2×PCR反应预混夜25μL、10μM引物各2μL、模板(按照6.3.1制备)4μL，无菌去离子水补足至50μL。将反应体系混匀后置于PCR仪中进行反应。以灭菌去离子水为空白对照，以水稻稻曲病菌DNA为阳性对照，以其他病菌DNA为阴性对照，每个样品重复2次。6.3.4PCR扩增条件94℃5min；9

7、4℃30s，61℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。反应结束后电泳分析PCR产物。7结果判定在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下：——待测样品扩增出346bp左右的条带，则判定为该样品水稻稻曲病菌PCR筛查结果为阳性。——待测样品未扩增出346bp左右的条带，则判定该样品水稻稻曲病菌PCR筛查结果为阴性。8样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对水稻稻曲病菌PCR检测结果为阳性的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌（121℃15min）后方可处理。2