爪蟾卵母细胞培养.doc

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1、爪赡卵母细胞的培养及Pf的测定一、卵母细胞的培养1.1爪塘的饲养取成熟的较大的雌性爪蟾，置于干净的玻璃水槽屮，水深度约15〜25cma每周需要换水两次。饲养水使用经在敞口容器屮放置3〜7d的自来水，但最好采用经去除氯和氯胺处理的饲养水。因为氯和氯胺对爪蟾的生长非常有害。爪赡每周需要喂养两次，每次喂食后更换饲养水。可用切碎的牛或其他动物的心脏，肝脏作为饲养食物，毎次每个爪媚约喂食5〜10go喂食时间持续约4〜6ho若食物长期比较单一。为了补充需要的钙和维生素D,需要在维生紊液屮提前浸泡食物。1.2

2、卵母细胞分离和培养用液体在细胞的分离和培养中主要使用以下液体:ND96：96mmol/INaCI,2mmol/IKCI,1.8mmol/lCaCI2,lmmol/1MgCI2,5mmol/IHEPES（超乙基哌秦乙硫磺酸,氢离子缓冲液）,用NaOH调节pH=7.5,高压高温灭菌。无钙ND96：去除ND96中的1.8mmol/lCaCI2即可。培养用ND95：向ND96中按105U/L，加入青霉素、500mg/l加入链霉素。13手术方法取爪嵋一只，掩埋于碎冰块中20〜30min,待其麻醉。可用手指

3、用力捏其后肢趾，若无较强伸缩反应,说明已经麻醉。将爪蟾腹部向上,放置在一平铺有碎冰块的手术用盘了屮，并用冰块掩埋其头部和四肢。室温下，在其左下腹或右下腹剪开一Icm左右的小口，先皮肤示肌肉，并将局部皮肤和肌肉分离。用银了和剪刀取足量的卵母细胞，并移至一预先倒入ND96的培养皿屮。用丝线缝合切口，先肌肉后皮肤。然后，将爪赡放冋到饲养水屮。1.4卵母细胞的分离在显徽镜下，左右手备持5号钟表银了，撕破包裹在卵母细胞外的膜性组织，并将成堆的卵母细胞撕成10~20个为一团的细胞团，注意尽最不要川银子触及或

4、刺破细胞。川移液管将细胞团移入一个12ml经消毒过的或一次性槊•料管屮，在移动中避免细胞与空气的接触。用无钙ND96冲洗5〜6次，除去液体屮残留的钙按照1.5mg/ml的比例，用无钙ND96配置消化分离用的胶原蛋白酶液体倣原蛋白酶使用SigmaCollegenaseTypeI）。将胶原蛋白酶液体移入经冲洗的卵母细胞報料管中拧紧盖子，并用封口膜封I」。置于带摇床的22C的恒温水浴槽屮并轻轻晃动（50次/min）lho取出后，可看到大多数细胞已经分离成单独的细胞，除去消化残液，用无钙的ND96冲洗5

5、〜6次，倒入一经灭菌的盛有ND96的培养川L中。1.5卵母细胞的挑选卵母细胞从其发冇的形态学上可分为5个期最早的I期细胞直径约50〜100/am并呈透明状III期细胞直径约300-450/am，呈半透明或白色，主要取决于其生长的程度；ITT期细胞真径约450〜600pm,在其表面有规则的着色区分布；期细胞一育径约600〜1000pm,具有黑棕色动物极半球和白色的植物极半球V期细胞右•径约1000-1200.urn,黑白两个半球界限非常清楚，且细胞膜表面光滑有光泽VI期细胞是报成熟的细胞，直径大约

6、1200^1300.um,动物极呈现深棕色，两个半球间有一条清晰的亮环赤道带。用于离了通道表达的卵母细胞一般选择v和VI期的细胞。健康的细胞具有明显的黑H两极，且颜色分布很均匀可。二、Pf的测定将爪蟾卵母细胞在ND96中培养两到三天后，转移到用蒸憎水稀释5倍的ND96屮，用连有数码相机的显微镜下记录细胞容积的变化，以5s为间隔连续拍照（使用LG-3GrayscaleScientificPCIFrameGrabber）,细胞表面积用塞恩图像软件进行分析，计算其相对体积。Pf计算公式:Pf=Vo[d

7、(V/V0)/dt]/[SxVw(Osmin-OsmoutV0:9*10'4立方厘米S:0.045平方厘米Vw：18立方厘米每摩尔