爪蟾卵母细胞固醇调控通路的建立及姜黄素的作用

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1、爪蟾卵母细胞固醇调控通路的建立及姜黄素的作用作者：沃立科范春雷沃兴德【摘要】　　［目的］在爪蟾卵母细胞中建立人类SCAP/SREBP固醇调控系统，利用此系统研究姜黄素对SCAP/SREBP调控通路的作用。［方法］构建带有绿色荧光报告蛋白基因的PLXRN4SREfpa质粒，将构建质粒和其他几种质粒分别提取混和成实验组质粒和对照组质粒，通过微注射的方法分别共注射到Ⅴ、Ⅵ爪蟾卵母细胞核内，与不同浓度的姜黄素共孵育3天，使用荧光定量PCR检测荧光表达量。［结果］相同浓度的姜黄素对注射含有固醇调节元件

2、质粒的卵母细胞荧光表达量要明显高于不含相应元件的质粒。［结论］构建的质粒pLXRN4SREfPA能在爪蟾卵母细胞中有效地应答SCAP、SREBP调控因子；通过影响SCAP/SREBP调控通路调节SRE1下游基因的表达可能是姜黄素调脂作用的机理之一；利用核内共注射的方法在爪蟾卵母细胞中建立的SCAP/SREBP调控系统可作为SCAP配体类药物快速筛选和作用机制研究的细胞模型。【关键词】爪蟾卵母细胞姜黄素SCAP/SREBP固醇调控通路　　Abstract:［Aim］Theexpresseds

3、ystemofsterolregulationbySCAP/SREBPPathinontheSREBPpathidofPLXRN4SREfpain.AfterthreedaysthefluorescenceintensityonthemembraneoftheOocyteseasuredbyFluoroanalyzer.［Results］Thefluoresecenceintensityonthemembraneoftheoocyteincreasedin.Thetrailgroupents

4、ofSCAP/SREBPpathorefluorscenceprotEinthanthecontrolgroup.［Conclusion］Theexperimentprovidesthatthecurcumincanupgradetheexpressionofloodelcanbeappliedforquickscreeningofthescapliganddrugsandinverstigatingthemechanismofthedrugs.　　Keyin;SCAP/SREBPregulat

5、ionpath.　　2结果　　21构建质粒与鉴定设计合成的含有SRE调控元件的pBSK4SRE质粒经上海生物工程技术公司测序符合设计要求,调节元件的序列与人类基因库中序列一致(图1)　　图1pBSK4SRE测序结果与设计的序列相符重构质粒pLXRN4SREGFP经2次双酶切，经PCR扩增后在琼脂糖电泳中可见1900bp和320bp两个产物（见图2）送上海生工进行测序。基因测序与酶切鉴定结果一致，证明pLXRN4SREfPA质粒构建成功(图3)(略)　　图2pLXRN4SREGF

6、P质粒PCR鉴定：pLXRN4SREGFP经2次双酶切后，用PCR进行扩增，可见两个扩增产物，分别为1900bp和320bp。(略)　　　　图3质粒pLXRN4SREGFP的测序结果及图谱(略)　　22姜黄素对爪蟾卵母细胞存活率的影响　　表1不同浓度姜黄素对爪蟾卵母细胞活性的影响(略)　　卵母细胞用含不同浓度姜黄素的培养液培养后生存率平均在90%以上,因此上述浓度和作用时间对爪蟾卵母细胞培养不影响细胞存活率。　　23姜黄素对爪蟾卵母细胞固醇调控通路的影响将碱裂解法提取的质粒pCMV

7、SREBP1a460、pCMVSCAP、pLXRN4SREfpa均稀释到1ng/nl，同比混合后核注射至爪蟾卵母细胞作为实验组，pLXRN4SREGFP、pCMVSCAP、pLXRN稀释到1ng/nl，同比混合后核注射至爪蟾卵母细胞作为对照组，未注射质粒的卵母细胞作为试剂空白组,使用不同浓度姜黄素培养液孵育3d后测定荧光表达量。　　表2不同浓度姜黄素对基因注射组荧光强度的影响(略)　　实验组与对照组比较,*P<005　　实验结果发现：姜黄素本身不会产生荧光，而当姜黄素与卵母

8、细胞孵育后则产生荧光，其荧光强度与对照组一致，然而实验组的荧光强度要明显高于对照组和试剂空白组。　　3讨论　　最近国外正在研制的新型调脂药物，试图从SREBP通路中寻找SCAP配位体药物，这类药物可通过与SRE1结合治疗由于LDL增加引起的高胆固醇血症，其降胆固醇效果优于他汀类。我们在前期工作中发现姜黄素具有明显降胆固醇作用［3,5］，并且可能通过LDL受体途径起作用，我们设想姜黄素也可以通过SREBP调节途径，具有SCAP配位体的效应，起到调节胆固醇的作用。固醇调节元件1（SterolReg